一种利用同位素稀释质谱法测量糖化血红蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用同位素稀释液相色谱串联质谱法检测待测样品中糖化血红蛋白含量方法。该方法包括如下步骤：1)向标准品溶液和待测样品中均加入a摩尔15N-HbA1c-13C和b摩尔15N-HbA0-13C，过固相萃取柱，获得待上机标准品和待上机待测样品；所述N15-HbA1-13Cc为经同位素15N、13C标记的糖化血红蛋白β链N末端的六肽链；所述N15-HbA0-13C经同位素15N、13C标记的非糖化血红蛋白β链N末端的六肽链；a、b均大于0；2)用液相色谱串联质谱仪对所述待上机标准品和待上机待测样品分别进行检测；3)从步骤2)的检测结果中得出所述待测样品中糖化血红蛋白的含量。本方法操作简单，比IFCC推荐的质谱方法更加准确、精密，具良好的特异性和灵敏度，有望成为糖化血红蛋白测定的决定性参考方法。

【技术实现步骤摘要】
一种利用同位素稀释质谱法测量糖化血红蛋白的方法
本专利技术涉及一种利用同位素稀释质谱法测定糖化血红蛋白的方法，特别涉及一种利用同位素稀释液相色谱串联质谱法准确测量待测样品中糖化血红蛋白含量方法。
技术介绍
糖化血红蛋白(缩写作hemoglobinA1c、HbA1c、A1C或HbA1c)是血液红细胞中的血红蛋白与葡萄糖结合的产物，可以反映测定前6-8周患者体内平均血糖水平，通常作为评估糖尿病患者体内血糖控制情况与疗效观察的主要指标，一般来说血红蛋白被糖基化的比例与一段时间内体内血糖浓度的水平成正比。对应的，非糖化血红蛋白用HbA0表示。目前，国际上定义HbA1c化学构成为葡萄糖稳定的连接在血红蛋白β链N末端缬氨酸(Val)残基上，即血红蛋白(血液)-N-(1-脱氧果糖基)血红蛋白β链(βN-1-deoxyfructosyl-hemoglobin)。葡萄糖进入红细胞后与血红蛋白HbA的β链N末端缬氨酸残基缩合，先形成一种不稳定的Schiff碱(醛亚胺结构)，即前HbA1c，再解离或经Amadori分子重排后形成HbA1c(醛酮结构)，此反应的过程是缓慢和不可逆的，并且由于红细胞内没有分解醛酮的酶，因此HbA1c浓度只与红细胞寿命和该时期体内血糖的平均浓度有关，不受运动或食物的影响，反映的是过去6-8周的平均血糖浓度，是目前国际上公认的用于评估糖尿病患者长期血糖状况的金标准。目前有超过20种不同的方法用于测量HbA1c，其主要的检测原理主要有如下3种：(1)离子交换层析法：它是基于不同组分的电荷差异进行分离的。葡萄糖与Hb的β链N末端Val连接降低了等电点，导致糖化Hb带的正电荷比未糖化Hb的少，与树脂的附着力小，可以分别用不同离子浓度的缓冲液在不同的时间将Hb从阳离子交换柱中洗脱下来，再根据每个峰值下的面积来计算HbA1c占总Hb的比例。但是该方法中Hb变异体会随HbA1c一起洗脱，影响HbA1c值，离子交换层析法受温度、pH值、抗凝剂和柱效的影响较大，从而使结果产生偏差。常规的离子交换HPLC法经过多年技术上的改进，检测精密度(CV)<1％、分辨率及抵抗多种糖化血红蛋白变异体的能力有了明显提高，基本可以达到临床需求，美国糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)的参考实验室也是使用Bio-Rex70阳离子交换树脂HPLC作为常规实验标准参考方法，但是非特异性的问题仍然不能完全克服。(2)亲和层析法：用于分离糖化与非糖化血红蛋白的亲和层析凝胶柱是交联了间氨基苯硼酸的琼脂糖珠。硼酸具有与整合在血红蛋白分子上葡萄糖的顺位二醇基作可逆结合反应的性质，致使HbA1c选择性地结合于柱上，而非糖化血红蛋白被洗脱，然后变换条件，又可以将HbA1c重新解离，获得纯化。除葡萄糖外，血液中其他糖类都可与硼酸基结合，因此该方法的检测结果为GHb总量，而不是HbA1c的含量，该方法不受温度、GHb变异体的影响，通过校准，其结果与离子交换法有良好的相关性，已被临床广泛采用。但该实验测定结果受到除血红蛋白β链N末端缬氨酸残基以外糖基化的影响。(3)免疫法：利用抗原、抗体反应的原理，使用单克隆或多克隆抗体与血红蛋白β-链上糖基化的N末端的4-8个氨基酸作为抗体识别位点，发生凝集反应，通过吸光度来测定凝集量，可用全自动生化分析仪进行检测。该抗原与IFCC参考系统用于制备一级参考物质的β链N末端6个氨基酸肽端极为相似，其参考范围(2.8％～4.9％)比其他方法更低，而与IFCC推荐的(2.85～3.81％)更为一致。但是，当Hb发生第6位氨基酸变异[HbS(β6glu→val)和HbC(β6glu→lys)]时将不会被识别，有报道对此变异进行实验显示，厂家间的检测结果存在着偏倚。2011年，参加卫生部临床检验中心HbA1c项目的实验室中，离子交换高效液相色谱和免疫比浊法最为普遍，实验室所占比例超过45％和25％，鉴于此，张传宝等对3个基于高效液相色谱和1个基于免疫比浊法原理的HbA1c测定系统的精密度和正确度进行验证，免疫法批内精密度CV为0.54％～1.02％，室内精密度CV为0.54％～1.17％；测定标准物质的均值(NGSP值)和标准物质定值的偏倚为-0.34％HbA1c～0.18％HbA1c，与IFCC定值导出的NGSP值的偏倚为-0.14％HbA1c～0.05％HbA1c，批内精密度和实验室内精密度及正确度性能均符合相关要求，认为可以满足临床工作的需要，具有广阔的应用前景。尽管HbA1C标准化测定的问题早在1984年即已提出，但直到1993年DCCT的结果发布后，才开始受到关注。美国、日本和瑞典等国家都分别建立了HbA1c国家标准纲要，其中最为“著名”的是NGSP(NationalGlycohemoglobinStandardizationProgram)计划。NGSP参考系统是以DCCT数值为基础，把NGSP参考实验室网络中各种实验方法都校准为DCCT参考方法，并建议各实验室只能采用被NGSP认可的方法来检测HbA1c，使临床实验室的检测结果与DCCT的检测结果更具有相关性，大大减少了各实验室之间的差异。NGSP主要内容为：NGSP管理委员会下设由中心参考实验室、一级参考实验室和二级参考实验室组成的参考实验室网络，其主要的职责为：(1)负责参与生产厂家的仪器校准；(2)负责对实验室和厂家进行正确度认证；(3)对常规实验室进行能力验证(proficiencytest，PT)。自NGSP计划建立以来，美国临床实验室间HbA1c测定的结果“从混乱进入有序”状态，目前参加NGSP活动的实验室室间CV小于5％，HbA1c结果与NGSP靶值的偏倚小于8％，并且自2005年以后，参加美国病理工作者协会(CollegeofAmericanPathologists，CAP)HbA1c室间质评的实验室，95％以上均经过了NGSP认证，经过CAP和NGSP两组织的共同监测，推进了临床实验室关于糖化血红蛋白的检测质量。1995年，日本糖尿病学会(JapaneseDiabetesSociety，JDS)采用HPLC方法制备了国家级的校准品(JDSCalibratorlot1)，推荐用于所有的常规糖化血红蛋白检测方法的定标，对HbA1c检测进行标准化，并且经过几年的努力，日本临床化学学会(JapaneseSocietyofClinicalChemistry,JSCC)采用KO500制备了国家二级校准品(JDS/JSCCCalibratorlot2)，实现了标准物质的溯源性。瑞典临床化学学会(SwedishSocietyofClinicalChemistry,SFKK)将MonoSHPLC方法作为国家指定参考方法，推荐用于糖化血红蛋白的标准化。具体实施内容为：每月一次，将乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的新鲜全血样本发放至40家使用HPLC方法的临床医院，其中有5家医院采用MonoSHPLC参考方法，从而达到对常规实验室的能力验证，并且作为重点关注的检验仪器，要求所有的医院每2年至少对糖化血红蛋白仪器进行校准一次。上述国家级参考方法均采用离子交换色谱法，由于受树脂种类、柱子规格、缓冲液组分、洗脱时间和色谱分辨率不同等原因的影响，检测结果也不同，在美本文档来自技高网...

【技术保护点】
同位素稀释液相色谱串联质谱法在测定糖化血红蛋白中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种利用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定待测样品中糖化血红蛋白含量方法，包括如下步骤：（1）向标准品溶液中加入a摩尔15N-HbA1c-13C和b摩尔15N-HbA0-13C，过固相萃取柱，获得待上机标准品；向待测样品中加入a摩尔15N-HbA1c-13C和b摩尔15N-HbA0-13C，过所述固相萃取柱，获得待上机待测样品；所述15N-HbA1c-13C为经同位素15N、13C标记的糖化血红蛋白β链N末端的六肽链；所述15N-HbA0-13C经同位素15N、13C标记的非糖化血红蛋白β链N末端的六肽链；a、b均大于0；（2）用液相色谱串联质谱仪对步骤（1）所得待上机标准品和待上机待测样品分别进行检测；（3）从步骤（2）的检测结果中得出所述待测样品中糖化血红蛋白的含量；步骤（2）中，所述用液相色谱串联质谱仪对步骤（1）所得待上机标准品和待上机待测样品分别进行检测，采用的色谱条件如下：色谱柱为C-18反相色谱柱；流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；流动相A：甲醇水溶液；流动相B：乙腈和甲酸的混合液；所述流动相中，所述甲酸水溶液中甲酸的含量为每1000ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋智心，王清涛，马怀安，张瑞，岳育红，左畅，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京朝阳医院，
类型：发明
国别省市：北京;11