本发明专利技术公开了一种糖原合成酶活性测定试剂盒及其方法，该试剂盒包含的试剂有：由Tris-HCl缓冲溶液组成提取液，由Tris、氯化镁、氯化钾、氢氧化钾、盐酸溶于蒸馏水后配制而成的试剂一，由Tris、氯化镁、EDTA、巯基乙醇、盐酸溶于蒸馏水后配制而成的试剂二，由乳酸脱氢酶组成的试剂三，由磷酸烯醇式丙酮酸、NADH和丙酮酸激酶组成的试剂四，由糖原、UDPG、6-磷酸葡萄糖组成的试剂五。本发明专利技术的方法通过丙酮酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的联合作用，利用分光光度计在340nm处测定NADH的氧化速率反映了糖原合成酶的反应产物UTP的生成速率，从而进一步反映了糖原合成酶的活性，该方法灵敏度高。目前市面上还没有一种有效的基于分光光度法的通过酶联合作用测定糖原合成酶活性的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生命科学领域领域，涉及一种试剂盒，具体涉及。
技术介绍
糖原合成酶(GCS)催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UTP，以α-l，4_糖苷键相连延长糖链，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰岛素作用的主要靶酶，对糖代谢的调节和血糖稳态的维持具有重要作用。目前市面已有的检测糖原合成酶的方法为漂洗法和固相滤纸法。这两种方法是基于UDP14CG在GS的作用下，合成具有放射性的糖原，采用漂洗或固相滤纸抽滤来分离带放射性标记的糖原和游离的UDP14CG，最后用液体闪烁计数仪检测放射强度的方法。漂洗法需要用大量的70%无水乙醇进行漂洗，耗时较长，且容易造成环境污染。固相滤纸法虽然克服了环境污染的缺点，但是仍存在以下几个缺点:1、糖原合成酶的提取液成分过多，成本较高；2、该方法需要用到放射性标记的UDP14CG，试剂成本较高;3、分离过程较为繁琐，耗时较长；4、所用到的设备-液体闪烁计数仪并未在一般实验室普遍使用。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术旨在提供，可快速准确的计算出糖原合成酶的活性。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现: 一种糖原合成酶活性测定试剂盒，包括以下试剂: 提取液，1瓶，4°C保存，由Tris-HCl缓冲溶液组成，置于60mL试剂瓶中； 试剂一，液体XI瓶，4°C保存，由Tris、氯化镁、氯化钾、氢氧化钾、盐酸溶于蒸馏水后配制而成，置于50mL试剂瓶中； 试剂二，液体X 1瓶，4°C保存，由Tr i s、氯化镁、EDTA、巯基乙醇、盐酸溶于蒸馏水后配制而成，置于5mL试剂瓶中； 试剂三:液体XI支，4°C保存，由乳酸脱氢酶组成，置于1.5mL离心管中； 试剂四:粉剂XI支，_20°C保存；由磷酸烯醇式丙酮酸、NADH和丙酮酸激酶组成，置于1.5mL离心管中； 试剂五:粉剂X 1瓶，_20°C保存；由糖原、UDPG、6-磷酸葡萄糖组成，置于5mL试剂瓶中。进一步的，所述提取液中，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mmol/L，pH=7.4，体积为60mL； 进一步的，所述试剂一中，Tris的质量为0.425g，氯化镁的质量为0.132g，氯化钾的质量为0.225g，氢氧化钾的质量为24.3mg，盐酸的体积为0.261mL，蒸馏水的体积为45mL ； 进一步的，所述试剂二中，Tri s的质量为30.25mg，氯化镁的质量为12.2mg，EDTA的质量为1.5mg，巯基乙醇的体积为luL，盐酸的体积为9.5uL，蒸馈水的体积为5mL ； 进一步的，所述试剂三中，乳酸脱氢酶的体积为41uL; 进一步的，所述试剂四中，磷酸烯醇式丙酮酸的质量为5.8mg，NADH的质量为7mg，丙酮酸激酶的质量为1.35mg; 进一步的，所述试剂五中，糖原的质量为17.5mg，UDPG的质量为lmg，6-磷酸葡萄糖的质量为 1.15mg0糖原合成酶催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UTP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映糖原合成酶活性。一种基于分光光度法的糖原合成酶活性测定方法，包括以下步骤: 步骤1仪器和用品的准备； 紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水； 步骤2样本的前处理； 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:(5?10)的比例，进行冰浴匀浆，再采用离心率8000g，在4°C下，离心lOmin，取上清，置冰上待测； 步骤3分光光度计的预热； 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馈水调零； 步骤4工作液的配置； 临用前将所述试剂三和所述试剂四转移到所述试剂一中，混合溶解待用，现配现用； 步骤5试剂五的配制； 临用前在所述试剂五瓶中加入2.5mL的所述试剂二，充分溶解待用，现配现用； 步骤6将步骤4中配制的所述工作液和所述试剂五置于37°C预热5分钟； 步骤7在lmL石英比色皿中加入50yL样本、50yL所述试剂五和900yL所述工作液，立即混勾，记录340nm处初始吸光值Αι和lmin后的吸光值A2，计算Δ Α=Αι_Α2 ； 注意:在该试剂盒中，若Δ A大于0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使Δ A小于0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。步骤8糖原合成酶活性计算； (1)按样本蛋白浓度计算: 单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗lnmol NADH定义为一个酶活力单位；糖原合成酶(U/mg prot) = -τ- (V样X Cpr) +T=3215 X Δ A +Cpr； (2)按样本鲜重计算: 单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位； 糖原合成酶(U/g 鲜重)= + (W X V样+%总)+T=3215 X Δ A 其中，￥反@=1 X 10—3 L，表示反应体系总体积； ε=6.22X 103 L / mol /cm，表示NADH摩尔消光系数； d=1 cm，表示比色皿光径； V样=0.05 mL，表示加入样本的体积； ^m=l mL，表示加入提取液的体积； T=1 min，表示反应时间； Cpr表示样本蛋白质的浓度，单位为mg/mL ； W表示样本的质量，单位为g。本专利技术的有益效果是: 1、本专利技术通过丙酮酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的联合作用，利用分光光度计在340nm处测定NADH的氧化速率反映了糖原合成酶的反应产物UTP的生成速率，从而进一步反映了糖原合成酶的活性，该方法灵敏度高。目前市面上还没有一种有效的基于分光光度法的通过酶联合作用测定糖原合成酶活性的试剂盒。 2、本专利技术的样本前处理过程快速，提取液成分简单，仅用50mM Tris-HCl，PH7.4的溶液即可，成本极低。3、本专利技术的测定步骤只需要在测定前简单配制工作液、试剂五以及预热分光光度计和试剂，一分钟内即可完成一个样本的测定，测定过程十分快速。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例详细说明。本专利技术的【具体实施方式】由以下实施例详细给出。【具体实施方式】下面将结合实施例，来详细说明本专利技术。实施例1 一种糖原合成酶活性测定试剂盒，包括以下试剂: 提取液，1瓶，4°c保存，由浓度为50mmol/L，pH=7.4，体积为60mL的Tris_HCl缓冲溶液组成，置于60mL试剂瓶中； 试剂一，液体X 1瓶，4°C保存，由0.425gTris、0.132g氯化镁、0.225g氯化钾、24.3mg氢氧化钾、0.261mL盐酸溶于45mL蒸馏水后配制而成，置于50mL试剂瓶中； 试剂二，液体X 1瓶，4°C保存，由30.25mgTris、12.2mg氯化镁、1.5mgEDTA、luL巯基乙醇、9.5uL盐酸溶于5mL蒸馏水后配制而成，置于5mL试剂瓶中； 试剂三:液体X 1支，4°C保存，由41uL乳酸脱氢酶组成，置于1.5mL离心管中； 试剂四:粉剂X 1支，_20°C保存；由5.8mg磷酸烯醇本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种糖原合成酶活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：提取液，1瓶，4℃保存，由Tris‑HCl缓冲溶液组成，置于60mL试剂瓶中；试剂一，液体×1瓶，4℃保存，由Tris、氯化镁、氯化钾、氢氧化钾、盐酸溶于蒸馏水后配制而成，置于50mL试剂瓶中；试剂二，液体×1瓶，4℃保存，由Tris、氯化镁、EDTA、巯基乙醇、盐酸溶于蒸馏水后配制而成，置于5mL试剂瓶中；试剂三：液体×1支，4℃保存，由乳酸脱氢酶组成，置于1.5mL离心管中；试剂四：粉剂×1支，‑20℃保存；由磷酸烯醇式丙酮酸、NADH和丙酮酸激酶组成，置于1.5mL离心管中；试剂五：粉剂×1瓶，‑20℃保存；由糖原、UDPG、6‑磷酸葡萄糖组成，置于5mL试剂瓶中。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵林川，
申请(专利权)人：苏州科铭生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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