本发明专利技术提供了一种可视化快速检测食品中伏马毒素的免疫亲和凝胶检测柱的制备方法。以琼脂糖凝胶为固相载体，将伏马毒素抗体和溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联制备抗体胶作为检测层，将HRP抗体与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联制备HRP抗体胶作为质控层，装入1mL的固相萃取柱，制备免疫亲和凝胶检测柱。本发明专利技术研制了一种新型快速定性半定量检测食品中伏马毒素的免疫亲和凝胶柱检测产品，检测限为40μg/L。发明专利技术具有以下突出的优点：1、特异性高，灵敏度好；2、样品前处理简单；3、检测耗时短，准确性高；4、操作简便，不需要大型仪器的辅助。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于小分子化合物免疫化学和残留分析
，涉及免疫化学、酶学与分析化学技术等，尤其是涉及一种伏马毒素免疫亲和凝胶可视化检测柱的制备。
技术介绍
伏马毒素(Fumonisins, FBs)是霉菌毒素之一，是由串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme She Id)在特定的温度和湿度下产生的水溶性代谢产物，多见于粮食和饲料中。其结构中含有一类不同的多氢醇和丙三羧酸，使其具有生物毒性，且对热很稳定，在多数粮食加工处理过程中均比较稳定，因此其经过粮食饲料的加工生产等过程后仍可以保持其毒性，对人类及畜牧业危害较大。其在人畜体内的作用比较复杂，可以抑制N-脂酰基神经鞘氨醇合成酶的合成，从而阻断神经鞘氨醇(Sphinngosine, SO)合成，破坏鞘脂类的代谢或影响鞘脂类的功能，这一抑制可引起二氢神经鞘氨醇(Shpinganine, SA)升高，导致组织、血、尿中SA/S0比值的升高。而细胞内自由SA的聚集是有毒性的，其量的平衡与否直接决定了细胞能否存活。1993年，国际癌症研究机构研究结果为(The Internat1nal Agencyfor Research on Caner)伏马毒素定位2B级致癌物质(可能是人类致癌物)，其可以引起人畜的中毒，由于人畜有种属和器官的不同，伏马毒素对不同种属的会引起其不同的病理反应，目前已知的病症主要有马脑白质软化症(Equine Leucoencephalomalacia ELEM)，猪的肺水肿(Pig Pulmonary Edema，PPE)，大鼠肝中毒及肝癌，还可以引起人类食道癌(HumanEsophageal Cancer, HEC),鸡的免疫系统紊乱及致死性疾病，狒狒的心血管病变以及羊类肾病变等。因此，为了保障人民健康必须建立灵敏度高、特异性强、简单快速测定方法对伏马毒素残留进行监控。目前报到的伏马毒素检测方法主要有:薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、免疫学检测方法等。高效液相色谱(HPLC)法准确度高，而且是目前应用最多的检测方法，但该方法存在一些缺点，如所需仪器既多又昂贵，且需专业人员进行操作，样品处理步骤繁锁，需要衍生，回收率低等问题，所以不适合广泛的推广使用。可视化快速免疫检测技术，像试纸条、凝胶检测柱等，是相对独立的快速检测方法。不需任何仪器设备，分析过程特别是前处理的步骤大大简化了，几分钟就可用肉眼观察实验结果，非常适合于大量样品的现场筛查和基层推广。因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。本论文借鉴凝胶柱免疫检测技术，为某些颜色较深及基质影响较大的样品中的伏马毒素残留检测分析，提供一种行之有效的可视化定性半定量快速简单检测方法，为食品安全的有力监管提供可靠的技术保障。
技术实现思路
本专利技术提出一种可以定性半定量的检测食品中的伏马毒素的简单、省时、灵敏的可视化免疫亲和凝胶检测柱的制备。只要样品中含有酶标记抗原，凝胶检测柱的质控层就会出现蓝色，它可以确保检测柱可以正常检测，达到质控的作用。以凝胶检测柱的质控层为基准，通过检测层颜色深浅变化达到定性或半定量检测食品样品中的伏马毒素的目的。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是:封闭胶的制备(1)溶胀:称取1.00g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到80mL的配制好的HC1溶液中，搅拌溶胀lOmin (溶胀后胶的终体积约为3.5mL)。(2)淋洗:将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mL HC1淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性。(3)封闭:加入9mL甘氨酸封闭液，密封柱子，室温下震荡反应2h。(4)清洗:首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍。(5)贮存:待清洗液抽空，制备好的封闭胶用PBS悬起，约10mL PBS (含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4°C保存待用。伏马毒素抗体胶和HRP抗体胶的制备(1)溶胀:准确称取0.50g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到40mL的配制好的HCL溶液中，搅拌溶胀lOmin (溶胀后胶的终体积约为1.8mL)。(2)淋洗:将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mL HCL淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性，将淋洗液全部淋完。(3)偶联抗体:取1.50mg/mL抗体，用lmL的偶联缓冲液稀释，然后加入到在具砂板层析柱中，密封柱子，室温下震荡反应2h。(4)封闭:加入10mL的偶联缓冲液淋洗柱子，然后加入10mL的封闭液，再次密封柱子，室温震汤反应2h。(5)清洗:首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍；(6)贮存:待清洗液抽空，制备好的抗体胶用PBS悬起，约5mL PBS (含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4°C保存待用。HRP抗体胶由HRP多克隆抗体与CNBr活化的琼脂糖凝胶偶联后制得，用于免疫亲和凝胶检测柱的对照层。HRP抗体胶的制备步骤同抗体胶制备过程。将所述封闭胶和抗体胶(HRP抗体胶)按一定比例混合制备凝胶检测柱的质控层和检测层，即:(1)质控层是由HRP抗体胶与封闭胶以一定比例混合好后，取150 μ L混合胶加入到lmL的SPE塑料柱中，用注射器活塞将PBS压出；(2)检测层是由优化好的抗体胶与封闭胶以一定的比例混合好后，取150 μ L加入其中，用注射器活塞将PBS压出；进一步的，所述质控层和检测层，制备检测柱，即:(1)检测柱由下到上，分别是对照层和检测层，对照层和检测层之间隔开一个3mm的空气层，可以防止加入底物显色后试剂和颜色从对照层迀移到检测层中。(2)首先将聚乙烯垫片加入lmL的塑料柱中，然后加入对照层混合胶，加入第二层聚乙烯垫片，在对照层上方约3mm处加入第三层聚乙烯垫片，然后加入其检测层的混合胶，最后在顶部加入第四层垫片。本专利技术创造所述的免疫检测柱相对于现有技术具有以下优势:(1)本专利技术提供的伏马毒素免疫亲和凝胶检测柱，可专一识别伏马毒素，具有非常尚的选择性。(2)本专利技术伏马毒素免疫亲和凝胶检测柱是一种可视化的定性半定量检测产品。对目标待测物的检测，检测柱会以检测层颜色的有无给出检测结果，即以是/否的可视定性信号给予应答，操作方便，结果判断简单。(3)本专利技术制得的伏马毒素免疫亲和凝胶检测柱既可以使之与净化柱串联，消除样品基质影响；又可容纳较大体积的清洗缓冲液和样品溶液，提高了方法灵敏度。检测产品前处理方法简便，快速，稳定性好，所用试剂均无毒、无污染，具有很好的易用性和准确性，满足现场快速检测的要求。【附图说明】构成本专利技术创造的一部分的附图用来提供对本专利技术创造的进一步理解，本专利技术创造的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术创造，并不构成对本专利技术创造的不当限定。在附图中:图1为本专利技术创造实施例所述的凝胶检测柱的组装示意图；1-注射器，2-转接头，3-进样口，4-聚乙烯垫片，5-检测层，6-空气层，7-质控层，8-出口。图2为本专利技术创造实施例所述的伏马毒素凝胶检测柱检测限的判定:伏马毒素浓度从左到右分别为:0 μ g/L, 20.0 μ g/L, 30.0 μ g/L, and 40.0 μ g/L ；图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测伏马毒素免疫亲和凝胶检测柱，其特征在于：凝胶检测柱的原理是利用抗原抗体的特异性结合和辣根过氧化物酶的酶催反应，依据质控层和检测层颜色变化，进而对待测物进行定性半定量分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：生威，王硕，张燕，王俊平，胡高爽，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。