本发明专利技术涉及电化学传感器技术领域，特别涉及基于目标物诱导的核酸适配体构象变化检测水胺硫磷的电化学传感器。具体制备方法为：对电极进行预处理；将CP层修饰到电极表面；将均相反应混合液与HAP1，HAP2修饰到电极表面。本发明专利技术利用了核酸适配体的特异型识别，利用水胺硫磷的aptamer作为识别物质实现了对目标物水胺硫磷的高特异性检测；利用杂交链反应放大技术，实现了信号的放大，提高了传感器的灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及电化学传感器
，特别涉及基于目标诱导的核酸适配体构象变化检 测有机磷农药的电化学生物传感器，还涉及其制备方法。
技术介绍
有机磷农药，是用于防治植物病、虫、害的有机化合物。这一类农药品种多、药效高，用 途广，在农药中是极为重要的一类化合物。但有不少品种对人、畜的急性毒性很强，在使用 时特别要注意安全。有机磷类农药对人的危害作用从剧毒到低毒不等。能抑制乙酰胆碱酯 酶，使乙酰胆碱积聚，引起毒蕈碱样症状、烟碱样症状以及中枢神经系统症状，严重时可因 肺水肿、脑水肿、呼吸麻痹而死亡。重度急性中毒者还会发生迟发性猝死。某些种类的有机 磷中毒可在中毒后8~14天发生迟发性神经病，有机磷中毒者血胆碱酯酶活性降低。目 前报道的检测有机磷农药的方法包括高效液相色谱法，毛细管电泳法，表面等离子体共振 方法和荧光共振方法。这些方法都具有检测成本高，仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺 点，因此，确立一个灵敏的高选择性的方法临床诊断和在食品安全分析中检测有机磷农药 是至关重要的。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测有机磷农药的方法特异性和灵敏度都比较低、成本 高的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于目标物诱导的 核酸适配体构象变化检测有机磷农药的电化学生物传感器。同时，本专利技术还提供了基于目 标物诱导的核酸适配体构象变化检测有机磷农药的电化学生物传感器的制备方法。 本专利技术是通过以下步骤得到的： 本专利技术中一共用到了 5条DNA链，其序列分别是： Aptamer :5' -AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3'（SEQ:ID:NO:1); Helper :5' -AGCTCTGTGCAGCCAAGCT-3'（SEQ:ID:N0:2); HAPI :5 ' -AGCTTGGCTGCACAGAGCTCAAGCT-3 '（SEQ:ID:NO:3); HAP2 :5' -AGCTTGAGCTCTGTGCAGCCAAGCT-3'（SEQ:ID:N0:4); CP :5' -SH-AGCTTGGCTG-3'（SEQ:ID:NO:5)。 Aptamer是抗水胺硫磷的适配体，Helper可以与aptamer杂交形成一个拱形探针。 CP的5'端修饰疏基，可以通过Au-S共价键固定在金电极表面。 本专利技术的实现是基于目标物诱导的核酸适配体构象变化的无酶检测有机磷农药 的电化学生物传感器。无酶检测提高检测的效率，传感器的稳定性。本专利技术中有机磷农药的 检测是在均相溶液中实现的，通过Helper诱导双发夹的链杂交反应来提高检测的灵敏度， 并获得较低的检测限。 均相中发生的反应是：当有目标物存在时，目标物与桥型探针中的aptamer发生 特异性识别与结合，从而将Helper释放出来，呈游离状态。在电极表面首先修饰一层捕 获探针（CP)，然后将均相溶液的反应产物与HAP1，HAP2混合液滴加到电极表面，在游离 He Iper的诱导下，修饰物中的双发夹发生杂交链反应，形成很长的杂交双链，并固定在电极 表面。然后将修饰好的电极在亚甲基蓝（MB)溶液中孵育lOmin，使MB固定在杂交双链上。 然后用电化学工作站检测其氧化还原峰。 在均相反应中，反应条件为37°C，反应时间是2h。 所述的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤： (1) 对电极进行预处理； (2) 将CP修饰到电极表面； (3) 将均相反应产物与HAP1，HAP2修饰到电极表面。 所述的制备方法，优选将CP修饰到电极表面的操作步骤如下：将10 μ L的CP溶 液滴加到经过预处理的电极表面，在37°C下孵育2h。 所述的制备方法，优选将均相反应产物修饰到电极表面的操作步骤如下： (1) 将灭菌水，5X的PBS、Aptamer、Helper和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放 入37°C的恒温箱中孵育2h ; (2) 将（1)中的混合溶液与HAP1，HAP2滴加到修饰好CP的电极上，将电极继续放在 37°C的恒温箱中孵育2h，清洗。 所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为，电极在0. 3和0. 05 Mm的氧化铝 浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。 所述的制备方法，优选所述电极为金电极。 该专利技术的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极， 铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将CP固定在电极表 面。然后将反应后的均相溶液与HAP1，HAP2修饰到电极表面，然后在37°C孵育2h完成电 极的修饰过程。最后将电极在MB溶液中孵育lOmin，使MB浸入杂交双链的凹槽中。然后 用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电 位设置为〇到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取MB 电信号的变化，检测待测目标物。 本专利技术基于核酸适配体与目标物的特异性识别，DNA链之间的碱基互补配对原则， 杂交链反应以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了电化学生物传感器。该传感器具有检测速 度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补有机磷农药现有检测方法的缺陷与不足，实现 对其快速，准确的定量检测。 本专利技术的有益效果： 1、 利用了核酸适配体的特异性识别，利用有机磷农药的aptamer作为识别物质实现了 对目标物的高特异性检测，在本专利技术中选择的有机磷农药是水胺硫磷； 2、 利用DNA杂交的碱基互补配对原则，利用杂交链反应实现了杂交双链的不断延伸， 可以固定大量的MB，放大了检测信号，提高检测灵敏度； 3、 该传感器的反应条件温和，反应速度快； 4、 由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用； 5、 检测原理的主要过程是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度， 实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测； 6、 制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于有机磷农药的检测和生物传感器 产业化的实际应用； 7、 制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。【附图说明】 图1为该实验的原理图； 图2为实施例1 HAPl浓度优化检测结果图； 图3为实施例2 Primer浓度优化检测结果图。【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明。 所述的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤： (1) 对电极进行预处理； (2) 将CP修饰到电极表面； (3) 将均相反应产物与HAP1，HAP2修饰到电极表面。 所述的制备方法，优选将CP修饰到电极表面的操作步骤如下：将10 μ L的CP溶 液滴加到经过预处理的电极表面，在37°C下孵育2h。 所述的制备方法，优选将均相反应产物修饰到电极表面的操作步骤如下： (1) 将灭菌水，5X的PBS、Aptamer、Helper和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放 入37°C的恒温箱中孵育2h ; (2) 将（1)中的混合溶液与HAP1，HAP2滴加到修饰好CP的电极上，将电极继续放在 37°C的恒温箱中孵育2h，清洗。 所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为，电极在0. 3和0. 05 Mm的氧化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于核酸适配体检测水胺硫磷的电化学传感器，其特征在于，包括以下步骤：（1）对电极进行预处理；（2）将CP修饰到电极表面；（3）将均相反应产物与HAP1, HAP2修饰到电极表面。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘素，黄加栋，王玉，王虹智，郭玉娜，许颖，邱婷婷，崔洁，崔雪君，冷雪琪，韩聪，裴倩倩，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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