样品的固定和稳定化制造技术

可以使用深共熔溶剂(DES)使诸如细胞、组织、活组织检查和血液等生物样品中的生物分子(例如RNA、DNA和蛋白质)稳定化。可以使用DES混合物来将诸如组织块、癌活组织检查和全血等生物样品中的细胞形态固定和保持。本发明专利技术描述了使用DES混合物稳定和保存生物分子、全细胞、组织、血液和生物样品的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】样品的固定和稳定化
本专利技术涉及生物分子特别是RNA的稳定化，包括用于稳定RNA的方法、用于稳定RNA的组合物和试剂盒和含有经稳定化RNA的组合物。还涉及细胞、组织、血液、外泌体和其他生物样品的固定和稳定化。
技术介绍
从生物样品提取完整生物分子是许多实验室和临床诊断步骤的关键部分。诸如核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质的不稳定性是公知的，并且其完整性取决于许多参数，例如样品在从其最初环境取出之前的物理条件，样品是如何快速地从其来源取出，样品冷却速率、样品贮存温度和生物分子纯化方法。众所周知的是，生物样品纯化之前和期间对生物样品进行处理可以引起样品分析物的完好性和完整性方面的非常重要的变化。例如众所周知的是，尤其是RNA是极其易变的分子，如果不正确地处理，其在数分钟内会完全不可逆地受损。虽然RNA可能是较为易变的生物分子之一，包括翻译后修饰在内的蛋白质、脂质、对于代谢分析而言关键的小于2000道尔顿的小分子和DNA也进行实质性的降解过程。虽然内源性细胞酶是大多数降解性过程的原因，分析物总是倾向于在贮存或处理的过程中同时水解，并且该过程很大地取决于诸如温度、含水量、pH、光和稳定性等贮存条件以及分析物分子的分子量，而且还可以取决于所用试剂的品质。成功贮存的最常见的简单方法之一是降低生物样品的温度。通常将样品贮存在低于室温(20℃～24℃)的温度；蛋白质溶液贮存在4℃或-20℃，核酸在干冰或液氮中贮存在-20℃或-80℃的冰箱中。可以添加诸如叠氮化钠等抗微生物剂以控制微生物生长。众所周知的是，RNA对于被酶降解、自发性水解、二价金属阳离子催化的水解、碱敏感性和FFPE(福尔马林固定的石蜡包埋的)样品中的交联特别敏感。诸如铅、镁和锰等许多金属溶液对RNA极具破坏性，并且确实不仅对于核酶而且对于诸如DNA酶I、绿豆核酸酶和S1核酸酶等核酸酶活性是关键的。铁(2+)已经作为芬顿反应的一部分参与核苷碱基的氧化，产生翻译上受损的rRNA和mRNA(Honda等人，(2005)J.Biol.Chem.280,20978-20986)，例如将鸟嘌呤转变为8-氧-鸟嘌呤。已经综述了金属离子在磷酸二酯键的酶促和非酶促切割中的其他可能的催化作用(Yarus,M.(1993)FASEBJ.7,31-39)。实际上经常将诸如EDTA和EGTA等螯合剂添加至RNA或RNA裂解液以用于通过除去金属离子来减少RNA降解的目的。核糖核酸酶(RNA酶)是一大组与包括微生物、人类皮肤、灰尘以及细胞和组织的内含物等许多来源相关的普遍存在的酶。在冷冻-解冻过程中他们也易于从细胞内囊泡释放。已知包括胰腺在内的一些组织特别富含RNA酶A。RNA酶A是已知最稳定的酶之一，在例如离液盐(chaotropicsalt)变性后容易恢复其酶促活性，使得其极其难以破坏。需要高浓度的离液剂(例如胍(4M～6M))来破坏RNA酶活性(Thompson.J.和Gillespie.D.AnalBiochem.(1987)163:281-91)。存在数种方法来抑制RNA酶活性，例如使用：(i)核糖核酸酶肽抑制剂(“RNasin”)，其是一种昂贵的试剂，仅以少量获得，并且对RNA酶A、B和C具有特异性；(ii)诸如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇等还原剂，其破坏RNA酶中的二硫键，但是该效果是有限的和临时的并且具毒性和不稳定；(iii)诸如蛋白酶K等消化RNA酶的蛋白酶，但是蛋白酶在试剂盒中的转运及其通常缓慢的作用使得分析物生物分子降解；(iv)将温度降低至低于酶的活性温度；常见的是将组织和细胞样品贮存在-80℃或在液氮中；(v)抗-RNA酶抗体；(vi)使用诸如丙酮等溶剂或诸如硫酸铵等亲液盐(kosmotropicsalt)将包含RNA酶、DNA和RNA的细胞蛋白沉淀，硫酸铵的一种市售制品称为RNAlaterTM(Sigma-Aldrich，美国；LifeTechnologies，美国；Qiagen,德国)；(vii)使全血中的核酸稳定化的洗涤剂，例如见于PAXgeneTMDNA和RNA提取试剂盒(PreAnalytix,德国)中的洗涤剂；(viii)离液盐；(ix)醇，例如见于PAXgeneTM组织稳定剂(PreAnalytix,德国)中的醇。RNAIsolationandAnalysis,Jones编(1994)第2章中提出了各种此类离液混合物。样品贮存的主要目标是将对分析物生物分子的任何改变最小化(所述改变可以是由于预分析步骤和样品纯化而引入)，从而使分析结果尽可能近地与生物分子的原始体内复杂性和多样性相似，由此提高检验精度、敏感性和特异性。虽然存在可用于减少预分析变化的各种方法和产品，其都有各种缺点，使得其使用存在问题或者是次优的。有效地稳定一类生物分子的方法通常对于稳定其他是无效的，对于每种生物分子分析物技术人员必须选择特定的试剂和方法。例如，PAXgeneTM体系(PreAnalytix)(美国专利6,602,718和6,617,170)可用于核酸，而不是蛋白质，并且需要冗长的纯化步骤以及多种洗涤缓冲液，同时蛋白酶抑制剂的混合物有助于防止蛋白质降解而不是核酸。PAXgeneTM组织稳定试剂盒需要对组织进行两个单独的处理，并且包括有毒和易燃的化学品。组织的RNAlaterTM处理减少了其在免疫组织化学、组织学的有用性，并且增加了组织硬度，而且没有完全保护RNA，虽然其已经被采纳为RNA保护的金标准品。在提取样品的时间或地点纯化RNA不总是可行的，所述样品例如来自医院手术室的活组织检验或来自医生办公室的血液样品。在这些情况下，在提取RNA之前样品必须非常仔细地贮存，RNA的提取可能短至30分钟进行，但是更常见的是仅仅在通过医院病理实验室处理后数小时或数天发生。通常对预分析步骤的时间和温度的记录较差，导致对样品品质的认知模糊。结果，需要针对每种组织和RNA的最终用途开发单独的样品贮存条件。如已提及，这通常包括使用专用的稳定液(例如RNAlater或PAXgene)或者立即将样品冷冻在液氮中。至少在PAXgene稳定剂的情况下，稳定剂的不完全去除会在纯化过程中对RNA产率产生负面影响(PAXgeneBloodRNAKitHandbook,2005年6月)。组织贮存可以通过使用固定剂的组织固化实现。“固定(fixation)”是指增加机械强度、硬化、防腐和增加诸如新鲜细胞、活组织检查或组织等受处理组织样品的稳定性，并且将样品保持在与处天然状态的原位的原始新鲜样品尽可能相似的状态。固定经常用于病理学、组织学、组织化学、细胞化学、解剖学研究和研究细胞，并且通常先于例如贮存、包埋、染色、免疫组织化学和/或免疫细胞化学等另外的步骤。固定方法理想地抑制诸如核酸酶和蛋白酶等酶，停止微生物在样品上的生长，并保持总体组织形态以及细胞超微结构如高尔基体、细胞核、内质网、线粒体、溶酶体和胞质膜。作为一个实例，保持正确的细胞形态对于病理学家诊断患者中癌的存在、类型和等级而言是重要的，但是为了正确地这样做，必须也能够将样品正确地染色或用抗体标记以用于免疫组织化学。通常样品用1％～5％的福尔马林(甲醛)、多聚甲醛或戊二醛的缓冲水溶液在室温处理1～24小时，以使蛋白质与其他细胞成分交联，然后本文档来自技高网...

【技术保护点】
深共熔溶剂抑制生物分子的降解的应用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.01 GB 1303666.01.深共熔溶剂抑制生物分子的降解的应用，其中，所述生物分子是RNA；其中，所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中所述第一组分是式I化合物：其中：R6是H或OH；R7选自H、CH3、Cl、Br、羰基氧和Z选自-CH2-、O和S；R8是R11或OH；且其中所述第二组分包含式II化合物或其盐：其中：A选自O、S和NH；R1选自H、具有1～6个碳原子的烯基、R9、-NH2、-NH-(CH2)nCH3和-C(R3)(R4)(R5)；其中n是0或1～5的整数；R2选自H和具有1～3个碳原子的直链烷基；R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环，其中所述取代基是R10；R4和R5各自独立地是H或F；且其中R9、R10和R11各自独立地选自具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基以及具有1～3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。2.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物分子存在于样品或组织中。3.如权利要求2所述的应用，其中，所述样品或组织包含实体组织。4.如权利要求2所述的应用，其中，所述样品或组织包含血浆、血清或全血。5.如权利要求4所述的应用，其中，所述全血包括循环肿瘤细胞。6.深共熔溶剂作为病毒、细胞或组织固定剂来产生经固定的病毒、细胞或组织的应用，其中，所述深共熔溶剂包含第一组分和第二组分，其中所述第一组分是式I化合物：其中：R6是H或OH；R7选自H、CH3、Cl、Br、羰基氧和Z选自-CH2-、O和S；R8是R11或OH；且其中所述第二组分包含式II化合物或其盐：其中：A选自O、S和NH；R1选自H、具有1～6个碳原子的烯基、R9、-NH2、-NH-(CH2)nCH3和-C(R3)(R4)(R5)；其中n是0或1～5的整数；R2选自H和具有1～3个碳原子的直链烷基；R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环，其中所述取代基是R10；R4和R5各自独立地是H或F；且其中R9、R10和R11各自独立地选自具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基以及具有1～3个碳原子的一氟烷基、二氟烷基或三氟烷基。7.如权利要求6所述的应用，其中，所述组织是全血。8.如权利要求7所述的应用，其中，所述全血包括循环肿瘤细胞。9.如权利要求6所述的应用，其中，所述组织是实体组织。10.如权利要求6～9中任一项所述的应用，其中，所述应用还包括处理所述经固定的细胞或组织，所述处理包括选自包埋、切片、染色、显微术、原位杂交、流式细胞术、免疫组织化学法和免疫细胞化学法中的一种或多种方法。11.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中：A选自O、S和NH；R1选自H、-CH＝CH2、R9、-NH2、-NHCH3和-C(R3)(R4)(R5)；R2选自H和-CH3；R3是可选地具有取代基的5元或6元脂族环或芳香环，其中所述取代基是R10；R4和R5各自独立地是H或F；并且其中R9、R10和R11各自独立地选自具有1～3个碳原子的烷基、具有1～3个碳原子的一氯烷基、具有1～3个碳原子的一、二或三氟烷基。12.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，A是O或S。13.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，R2是H。14.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，R1选自H、R9、-CH＝CH2和C(R3)(R4)(R5)。15.如权利要求14所述的应用，其中，R1是R9。16.如权利要求15所述的应用，其中，R9具有1个碳原子。17.如权利要求16所述的应用，其中，所述第二组分是乙酰胺。18.如权利要求16所述的应用，其中，所述第二组分是2-氯乙酰胺。19.如权利要求16所述的应用，其中，R9是一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。20.如权利要求19所述的应用，其中，所述第二组分是三氟乙酰胺。21.如权利要求19所述的应用，其中，所述第二组分是三氟硫代乙酰胺。22.如权利要求19所述的应用，其中，所述第二组分是N-甲基三氟乙酰胺。23.如权利要求15所述的应用，其中，R9具有2个碳原子。24.如权利要求23所述的应用，其中，R9是一氟乙基、二氟乙基或三氟乙基。25.如权利要求24所述的应用，其中，所述第二组分是2,2-二氟丙酰胺。26.如权利要求24所述的应用，其中，所述第二组分是3,3,3-三氟丙酰胺。27.如权利要求14所述的应用，其中，所述第二组分是甲酰胺。28.如权利要求14所述的应用，其中，所述第二组分是丙烯酰胺。29.如权利要求14所述的应用，其中，R1是C(R3)(R4)(R5)。30.如权利要求29所述的应用，其中，R4和R5是F。31.如权利要求29或权利要求30所述的应用，其中，R3是可选地具有取代基的苯基，其中，当所述取代基存在时，所述取代基位于所述苯基的2位，并且是一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基。32.如权利要求31所述的应用，其中，所述第二组分是2,2-二氟-2-苯基乙酰胺。33.如权利要求31所述的应用，其中，所述第二组分是2-(三氟甲基)苯基乙酰胺。34.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，R1选自-NH2和–NHCH3。35.如权利要求34所述的应用，其中，所述第二组分是尿素。36.如权利要求34所述的应用，其中，所述第二组分是...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·S·戈尔兹伯勒，M·R·贝茨，
申请(专利权)人：A·S·戈尔兹伯勒，M·R·贝茨，
类型：发明
国别省市：法国;FR