本发明专利技术中，作为采用酶催化剂的甲基丙烯酰-CoA的制造方法，提供通过具有脱水酶活性的酶，将3-羟基异丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA转变的甲基丙烯酰-CoA的制造方法。在该制造方法中，具有脱水酶活性的酶的从3-羟基异丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA的转变率为50％以上。此外，在该制造方法中，具有脱水酶活性的酶可以为属于假单胞菌属或红球菌属的微生物来源的酶。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】
本专利技术涉及使用了酶催化剂的。
技术介绍
甲基丙烯酸酯主要作为丙烯酸系树脂的原料来使用。此外，作为其它的涂料、粘接剂、 树脂改性剂等领域的共聚单体也有大量需求。作为工业制法，有若干方法，例如，已知以丙 酮和氰化氢作为原料的ACH(丙酮氰醇）法、以异丁烯、叔丁醇作为原料的直接氧化法。这 些化学制造方法依赖于化石原料，而且需要大量能量。 近年来，从防止地球变暖和环境保护的观点考虑，作为成为以往的化石原料的替代品 的碳源，由生物质制造各种化学制品的技术受到关注。也期待甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯 从生物质原料制造。 例如提出了，利用天然存在的微生物，由糖等天然物生产成为甲基丙烯酸的前体的 2_羟基异丁酸和3-羟基异丁酸的方法（参照专利文献1、2和非专利文献1)。此外，提出了 使用导入了酶基因的天然不存在的重组微生物而由葡萄糖生成甲基丙烯酸的方法，但这些 方法是组合了已知的酶反应以及由此类推的假想的酶反应的方法，并未被证实（参照专利 文献3~5)。这些公报中，关于3-羟基异丁酸或3-羟基异丁酰-CoA的酶脱水反应，有能 够利用催化类似反应的酶的主题的记载。确实可以认为，由于位于丙酮/ 丁醇发酵途径的 烯酰基-CoA脱水酶催化脱水反应，因此这些酶只要以上述化合物作为底物，则能够利用。 另一方面，脂肪酸的β -氧化或支链氨基酸的分解途径的烯酰基CoA脱水酶为催化水合反 应的酶，并不催化脱水反应。 在非专利文献2中示出，由聚-3-羟基丁酸酯产生菌精制后的烯酰基-CoA脱水酶具有 3-羟基丁酰-CoA的脱水反应及其逆反应（水合反应）的活性，但其它烯酰基-CoA脱水酶 是否进行两方向的反应还不清楚。进一步，这些现有技术中，实际上并未报告是否能够以 3_羟基异丁酰-CoA作为原料，合成甲基丙烯酰-CoA。如果考虑酶的多样性、底物特异性， 则是否能够用催化类似反应的酶来制造与本来的底物结构不同的甲基丙烯酰-CoA是不清 楚的。 另一方面，甲基丙烯酰-CoA作为缬氨酸分解途径中的中间体是已知的。此外，被认为 具有细胞毒性，推定在生物体内通过烯酰基CoA脱水酶的作用，甲基丙烯酰-CoA迅速地被 水合，经过3-羟基异丁酰-CoA，代谢成3-羟基异丁酸。 在非专利文献3中示出，从甲基丙烯酰-CoA向3-羟基异丁酰-CoA的采用巴豆酸酶的 水合反应的例子。虽然有本反应与其它反应（丙烯酰-CoA -羟基丙酰-CoA)相比，反应以 低转化率达到平衡的主旨的记载，但本反应为原料使用了甲基丙烯酰-CoA的水合反应的 情况，以3-羟基异丁酰-CoA作为原料实际上是否进行脱水反应完全不清楚。进一步，在非 专利文献4中记载了甲基丙烯酰-CoA自发地被水合。在甲基丙烯酰-CoA本身自发地被水 合那样的水中的环境下，实际上是否能够进行3-羟基异丁酰-CoA的脱水反应，制造作为本 专利技术的目标物质的甲基丙烯酰-CoA完全不清楚。 现有技术文献 专利文献 专利文献1:国际公开第2007/110394号 专利文献2:国际公开第2008/145737号 专利文献3:国际公开第2009/135074号 专利文献4:国际公开第2011/031897号 专利文献5:国际公开第2012/135789号 非专利文献 非专利文献 I: Green Chemistry，2012,14,1942-1948 非专利文献 2:Biochemistry，1969,8, 2748-2755 非专利文献 3: Journal of Biological Chemistry，1994, 269,14248-14253 非专利文献 4: Journal of Biological Chemistry，1957, 224,1-11
技术实现思路
专利技术所要解决的课题 本专利技术的目的是提供采用酶催化剂的。 用于解决课题的手段 发现从3-羟基异丁酰-CoA通过具有脱水酶活性的酶的作用，能够合成甲基丙烯 酰-CoA，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如以下所述。 (1) 一种，在脱水酶的存在下，将3-羟基异丁酰-CoA向甲 基丙烯酰-CoA转变。 (2) 根据（1)的制造方法，使用从3-羟基异丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA的转变率为 50%以上的脱水酶。 (3) 根据（1)或（2)的制造方法，在pH4~10的反应条件下向甲基丙烯酰-CoA转变。 (4) 根据⑴~（3)的任一项的制造方法，在温度5~80°C的反应条件下向甲基丙烯 酰-CoA转变。 (5) 根据（1)~（4)的任一项的制造方法，在时间1分钟~1周的反应条件下向甲基丙 烯酰-CoA转变。 (6) 根据（1)~（5)的任一项的制造方法，3-羟基异丁酰-CoA由包含ImM以上渗透压 调节剂的水性介质调制而得。 (7) 根据（1)~（6)的任一项的制造方法，在表达编码脱水酶的基因的转化体的存在 下，将3-羟基异丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA转变。 (8) 根据（7)的制造方法，编码脱水酶的基因是微生物来源的基因。 (9) 根据（8)的制造方法，微生物为属于假单胞菌属或红球菌属的微生物。 (10) 根据（7)的制造方法，脱水酶选自由下述（a)~（f)所组成的组。 (a) 包含序列号1或3所示的氨基酸序列的蛋白质。 (b) 包含在序列号1或3所示的氨基酸序列中缺失、置换、附加和/或插入了 1个或几 个氨基酸的氨基酸序列，并且具有脱水酶活性的蛋白质。 (c) 与包含序列号1或3所示的氨基酸序列的蛋白质显示90%以上的同一性，并且具 有脱水酶活性的蛋白质。 (d) 由包含序列号2或4所示的碱基序列的DNA编码的蛋白质。 (e) 由与包含序列号2或4所示的碱基序列的DNA在严格的条件下杂交的DNA编码，并 且具有脱水酶活性的蛋白质。 (f) 由与包含序列号2或4所示的碱基序列的DNA显示90%以上的同一性的DNA编码， 并且具有脱水酶活性的蛋白质。 (11) 一种，在表达编码微生物来源的脱水酶的基因的转 化体的存在下，使由包含ImM以上渗透压调节剂的水性介质调制而得的3-羟基异丁酰-CoA 水溶液，在PH4~10、温度5~80°C、时间1分钟~1周的反应条件下反应，从而以转变率 50%以上将3-羟基异丁酰-CoA向甲基丙烯酰-CoA转变。 专利技术的效果 通过本专利技术，能够实现采用酶催化剂的甲基丙烯酰-CoA的制造，通过将本专利技术的制造 方法与生物体内代谢等组合，也可以达成甲基丙烯酸及其酯的发酵生产。其结果是与以往 的化学制造工艺相比，可以显著降低对能量、资源、环境的负荷，并且能够有效率地制造甲 基丙烯酸酯。 【具体实施方式】 以下，详细说明本专利技术。 在本专利技术中，所谓甲基丙烯酰-CoA，为以下的式（1)所示的化合物，在生物体内作为缬 氨酸的代谢中间体是已知的。成为本专利技术中的甲基丙烯酰-C0A的制造原料的3-羟基异丁酰-CoA为以下的式（2) 所示的化合物，在生物体内作为缬氨酸的代谢中间体是已知的。本专利技术中使用的3-羟基异丁酰-CoA可以使用通过公知或新的方法制造的3-羟基异 丁酰-CoA。作为其合成方法，已知有机化学合成的方法（Angew. Chem. 1953,65,186-187) 或使用了酶反应的合成方法。进一步，可以使用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲基丙烯酰‑CoA的制造方法，在脱水酶的存在下，将3‑羟基异丁酰‑CoA向甲基丙烯酰‑CoA转变。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：佐藤荣治，汤不二夫，中岛永二，山崎伦子，水无涉，
申请(专利权)人：三菱丽阳株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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