本发明专利技术公开了一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，包括如下步骤：（1）采集分娩后的大熊猫在不同阶段的乳汁，（2）通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分因子进行推测鉴定，（3）将成分因子经过PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段进行分类，（4）通过OPLS-DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分因子，并对这些成分因子进行成分鉴定，（5）通过OPLS分析方法将这些被鉴定的成分因子的成分浓度变化情况与大熊猫幼仔体重增长率进行关联分析，最终筛选到大熊猫乳汁中对于大熊猫幼仔生长具有关键作用的因子。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于大熊猫人工养殖领域，具体涉及一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方 法。
技术介绍
大熊猫育幼成活难曾经是圈养大熊猫"三难"问题之一。综合统计表明，在圈养条 件下，从1963年-1990年的27年里，大熊猫幼仔的成活率（半岁）仅为33. 9%。上世纪 90年代以来，由于大熊猫幼仔出生时非常严重的免疫缺陷，科学家认识到对大熊猫幼仔及 时补充母兽初乳的重要性。科学家通过开展大熊猫母兽与人工轮换哺育幼仔以及人工补充 初乳的方式，大熊猫幼仔的成活率已经得到了显著提高。近5年来，幼仔成活率保持在90% 以上。尽管已经意识到初乳对于大熊猫幼仔建立被动免疫的重要性，但是截止到目前为止， 大熊猫乳汁尤其是初乳中对于幼仔免疫力发育至关重要的蛋白成分未能进行有效分析。之 前的相关研究主要集中于测定乳汁中的粗蛋白含量，大熊猫乳汁蛋白的氨基酸序列分析及 其功能性研究并未开展。关于大熊猫乳汁中其它营养成分的分析，之前的研究主要集中于 测定乳汁的粗脂肪、粗灰分、乳糖、矿物元素、维生素等营养物质。由于受到仪器设备及大熊 猫乳汁样本数量的限制，大熊猫在不同泌乳阶段的营养成分分析未能开展研究。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种，解决大熊猫乳汁尤其 是初乳中对于幼仔免疫力发育至关重要的蛋白成分未能进行有效分析的问题。 本专利技术的技术方案为：一种，包括如下步骤： (1)采集分娩后的大熊猫在不同阶段的乳汁， (2)通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分因子进行推测鉴定， (3)将成分因子经过PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段进行分类， (4)通过0PLS-DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分因子， 并对这些成分因子进行成分鉴定， (5)通过0PLS分析方法将这些被鉴定的成分因子的成分浓度变化情况与大熊猫 幼仔体重增长率进行关联分析，最终筛选到大熊猫乳汁中对于大熊猫幼仔生长具有关键作 用的因子。 进一步地，步骤（2)中通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分进行推测鉴定的 步骤为： 1)将采集的乳汁经降解离心处理后通过LC-MS处理，得到乳汁成分的液相质谱数 据； 2)将液相质谱数据与代谢组学数据库对比，筛选得到成分因子LC-HRMS因子。 进一步地，步骤（2)中通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分进行推测鉴定的 具体方法为： 在室温溶解采集的乳汁样品，各取50 μ1乳汁样品加入体积比为1:1的methanol/ acetonitrile溶液，混合溶液，超声波降解20秒，15000rpm，4°C离心10min，取上清液，将 上清液样品置入Accela 600HPLC系统后，系统从HiChrom中吸取10ul各样品溶液注入 ZIC-pHILIC柱中，整个LC-MS分析过程中，样品上机顺序安排为随机，将所得到的数据输出 到 Excel表中，消除背景噪音，信号的最大强度必须超过空白对照信号的20倍，否则便被从 库中移除，之后用代谢组学数据库并基于准确分子量推测鉴定到乳汁的成分因子LC-HRMS 因子。 进一步地，步骤（3)中将成分因子经过PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段进行 分类的方法为：将经过LC-MS分析后的大熊猫乳汁中的成分因子LC-HRMS因子进行PCA和 HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段分为初乳阶段、后初乳阶段和常乳阶段；初乳阶段为1-6天， 后初乳阶段为6-20天，常乳阶段为20天以上。 进一步地，通过0PLS-DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分 因子，并对这些成分因子进行成分鉴定的方法为：根据分类结果将乳汁样品在7天前后的 代谢产物分子浓度分别进行准确测定，并进行0PLS-DA分析，筛选出初乳及常乳中信号强 及浓度较高的成分因子LC-HRMS因子，将这些成分因子通过MZMine 2. 10和标准品或元素 组分分析进行成分鉴定工作。 进一步地，通过0PLS分析方法将这些被鉴定的成分因子的成分浓度变化情况与 大熊猫幼仔体重增长率进行关联分析，最终筛选到大熊猫乳汁中对于大熊猫幼仔生长具有 关键作用的因子的方法为：记录大熊猫幼仔出生后每天的体重，将当天较前一天体重的增 长百分比作为大熊猫体重增长率；鉴定到的乳汁的成分因子LC-HRMS因子的浓度变化作为 X变量，将大熊猫幼仔体重增长率作为Y变量，经过0PLS分析，得到与大熊猫幼仔体重增长 率显著相关的成分因子，即为大熊猫乳汁中的关键因子。 本专利技术与现有技术相比具有如下优点： 本专利技术首次提出对大熊猫乳汁开展了代谢组学研究。传统的大熊猫乳汁营养成分 研究仅对乳汁中的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纤维、碳水化合物进行了研究，而代谢组学分 析方法更精准的对乳汁中的代谢物质进行定性和定量分析，并且可以将这些代谢物质与大 熊猫幼仔生长情况进行关联性分析。【附图说明】 图1 :55份大熊猫乳汁样品HCA㈧树状图及PCA主成份分析点状图（B⑶）；圆圈： 丽丽（LL);星状：圆圆（YY);菱形：小丫头（XYT)。样品在PCA点状图上按深浅被分成不同 的组，并分别对应HCA图上用点状线分隔的几个部分。质量控制的样品（丽丽19天1、2、3 号样品）在图中圈出； 图2 :55份大熊猫乳汁样品0PLS-DA回归分析的S-plot图，初乳（7天以内）与常 乳（7天之后）比较。初乳中最高的50种因子与常乳中最高的20种因子分别用深色及浅 色标出。插入的图片是两种寡糖异构体N262与N351的变化趋势； 图3 :图中A为21份圆圆样品0PLS回归分析图，LC-HRMS数据为X变量，大熊猫幼 仔体重增长率为Y变量；B为大熊猫初生幼仔体重变化趋势；C，D，E和F为各关键因子在大 熊猫哺乳期的变化趋势。【具体实施方式】 1.材料和方法 1. 1实验材料 采用了莉莉，圆圆，小丫头三只大熊猫共55份乳汁样品。样品在采集以后2小时 内放入-80 °C保存一直到分析之前。 三种人工乳：安婴儿奶粉（美赞臣公司）、美国猫狗奶粉（No. IL-BLD-004, Illinois USA)和 Panda milk-10 (日本森永公司）。 表1试验动物情况表 表2采样信息表 1· 2实验仪器和试剂实验仪器：Accela 600HPLC 系统与 Exactive (Orbitrap)超高分辨质谱仪（Thermo Fisher Scientific, Germany)〇试剂：高效液相色谱级乙腈（Fisher Scientific)、Ammonium carbonateand (Sigma-Aldrich)、ammonium hydroxide solution (28-30 %) (Sigma-Aldrich)、metabolite standards 标准物。 1· 3实验方法 1. 3. 1样品处理 室温溶解样品。各取50 μ1奶样加入methanol/acetonitrile 1:1 (v/v)溶液，混 合溶液，超声波降解20秒。15,000rpm，4°C离心10min。取上清，加入HPLC仪器特定的管 中，进行LC-MS分析。 1. 3. 2HILIC - HRMS and HRMSn分析样品置入 Accela 600HPLC 系统后，系统从 HiChrom(流动相 A :20本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）采集分娩后的大熊猫在不同阶段的乳汁，（2）通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分因子进行推测鉴定，（3）将成分因子经过PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段进行分类，（4）通过OPLS‑DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分因子，并对这些成分因子进行成分鉴定，（5）通过OPLS分析方法将这些被鉴定的成分因子的成分浓度变化情况与大熊猫幼仔体重增长率进行关联分析，最终筛选到大熊猫乳汁中对于大熊猫幼仔生长具有关键作用的因子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张志和，张亮，王海瑞，侯蓉，马尔科姆肯尼迪，张文平，刘玉良，蔡志刚，凯特格里菲斯，张瞳，张荣，大卫沃森，理查德波奇默，卡地罗菲尔，
申请(专利权)人：成都大熊猫繁育研究基地，
类型：发明
国别省市：四川;51
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