一种酵母乙醇提取物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酵母乙醇提取物，酵母经发酵培养后，对菌体进行收集，菌体经机械破壁处理后，将上清液用乙醇沉淀，使上清液中乙醇的浓度为70V%，分离得到沉淀物即为酵母乙醇提取物；本发明专利技术还公开了一种利用上述酵母乙醇提取物促进微生物生长的方法和上述酵母乙醇提取物结合乳糖促进基因工程菌蛋白高效表达方法，通过上述方法，菌体量提高了3-10倍且相应诱导表达的目的蛋白表达量得到明显增加，能有效替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂使用；同时，缩短了培养周期，降低了生产成本，易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产，为微生物发酵、蛋白质生产及生物酶制备提供了新的方法及思路，对发酵产业具有深远影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵及基因工程
，具体涉及。
技术介绍
用于工业、农业、轻工业和医学研究与生产的每种微生物都需要在合适的营养才能生长，除需要碳源、氮源、无机盐和水外，还需要各种生长因子，因而，开发一种适用于各种微生物快速生长的添加剂对微生物工业生产具有举足轻重的作用。现有工艺中，所提到酵母抽提物，是以蛋白质含量丰富的酵母为原料，在破壁后，经生物酶解和加热等方法获得，因采用了酶解及加热方法等手段，破坏了对菌体有用的活性成分，虽然常作为微生物发酵培养机的成分之一，但主要解决了培养基的氮源问题。另外，在促进蛋白的表达方面，常用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，然而，IPTG具有一定的缺陷，一是对微生物有毒副作用，抑制菌体生长，从而影响蛋白的表达量，二是IPTG诱导蛋白表达过快，对蛋白的表达后折叠不利，容易形成包涵体；三是IPTG不可以通过代谢清除，有残留且有一定潜在毒性，不适合在工业化大生产中生产用于人的基因工程药物，目前，虽然也有单独通过添加如谷氨酰胺、精氨酸或乳糖到培养基中，但总体效果不是十分理想，因而总的来说，国内外没有一种效果显著的细菌生长及蛋白表达促进剂。
技术实现思路
本专利技术提供了一种酵母乙醇提取物，相对于传统方法制备的酵母提取物，条件更温和，得到的活性成分更高。为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案是这样的，一种酵母乙醇提取物，由以下方法制备而得，酵母经发酵培养后，对菌体进行收集，菌体经机械破壁处理后，上清液用乙醇沉淀，使上清液中乙醇的浓度为70V%，分离得到沉淀物即为酵母乙醇提取物。。本专利技术的酵母乙醇提取物，是以蛋白质含量丰富的酵母为原料，经破壁后，将其中水溶性的肽、核苷酸、各种糖、氨基酸、维生素等经温和的乙醇进行抽提，提取物添加到传统的发酵培养过程中作为微生物生物发酵的蛋白表达及生长促进剂，结果表明该提取物能够强力促进细菌生长及蛋白表达，相对于传统的本酵母提取物来说，能更好地促进微生物生长及促进工程菌的蛋白的合成的原因是因本专利技术采用了温和的乙醇提取方法，没有通过加热等传统方法，获得的酵母提取物中的各种活性成分明显高于传统方法制备的酵母提取物。经检测，本专利技术的酵母乙醇提取物中富含烟酰胺、烟酸、谷胱甘肽、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其他核苷酸、6-磷酸果糖、1，6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油醛、各种小肽、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸二十种氨基酸、各种维生素及微量元素等多种具有促进微生物生长及蛋白快速合成的促进因子。本专利技术还提供了一种促进基因工程菌外源蛋白表达的复配剂，由上述的酵母乙醇提取物和乳糖按重量比1-15:1复配而成。进一步优化后，其中，酵母乙醇提取物和乳糖优选地按重量比5:1复配而成。本专利技术的复配剂兼有诱导蛋白表达和促进蛋白合成的双重作用，能够替代IPTG作为诱导剂来诱导目的蛋白的表达，与IPTG作为诱导剂相比，具有如下优点:1、成分全部为天然、无毒的食品级物质，能够被微生物完全利用，不会有毒性残留；2、能够促进微生物的生长，诱导后的0D600比利用IPTG作为诱导剂时提高3倍以上；3、蛋白的表达量与利用IPTG作为诱导剂相比提高了 50-400%，且表达的蛋白可溶性好、包涵体少；4、价格低廉，大大降低工业生产和实验研究的成本。本专利技术还提供了一种促进微生物生长的方法，在微生物发酵时，添加上述的酵母乙醇提取物。为了更好地促进生物生长，在微生物发酵8-18小时后，添加上述的酵母乙醇提取物。优选地，酵母乙醇提取物添加量为0.5-5 g/100mL， 进一步优化后，酵母乙醇提取物添加量优选地为1.25 g/100mL。上述的酵母乙醇提取物可以对各种微生物，包括大肠杆菌、枯草杆菌、谷氨酸棒杆菌及其相应工程菌的生长具有促进作用，具体包括以下步骤: 1)将灭菌后的LB培养基或M9培养基接入需要培养的菌种； 2)培养8-18小时后加入上述的酵母乙醇提取物，使发酵液中酵母乙醇提取物的浓度为 1.25 g/100mL ； 3)继续培养6h； 经测定，与传统培养方法未加入酵母乙醇提取物相比，菌体量提高了 3-10倍。本专利技术还一种促进基因工程菌外源蛋白表达的方法，在工程菌发酵培养至菌体达到对数生长期后，向发酵液中加入上述的复配剂，使发酵液中复配剂的浓度为1.25g/100mL，继续培养3-8h，即可。上述的复配剂用于促进基因工程菌外源蛋白表达的方法，具体包括以下步骤: 1)将灭菌后的LB培养基或M9培养基接入需要培养的基因工程菌菌种； 2)当培养的菌体达到对数生长期后加入上述的复配剂，使发酵液中复配剂的浓度为1.25 g/100 mL ； 3)继续培养3-8h。经测定，与传统培养方法加入IPTG相比，菌体量提高了 3-10倍，SDS-PAGE鉴定蛋白表达效果发现，被诱导的蛋白量也得到明显的增加。有益效果: 1、本专利技术的酵母乙醇提取物，相对于传统方法制备的酵母提取物，条件更温和，得到的活性成分更高。2、本专利技术的酵母乙醇提取物对各种微生物及基因工程菌的生长有明显的促进作用。3、本专利技术的酵母的乙醇提取物除了能促进微生物快速生长外，许多活性成分能够为蛋白合成提供充分的能量如ATP等，使异源蛋白合成加快，因而酵母的乙醇提取物与乳糖的联合使用兼有诱导蛋白表达和促进蛋白合成的双重作用，达到高效诱导表达的目的，相对于单独用乳糖作为诱导剂相比，效率更高，特别是该提取物与乳糖联合使用，在基因工程菌的诱导表达方面能有效替代异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG )作为诱导剂使用，且诱导效果明显优于IPTG，另外，由于采用的是生物来源的活性物质，诱导后能够完全被微生物利用，没有任何残留，对药品中无IPTG残留的制药行业具有十分重要的现实意义。4、本专利技术的酵母乙醇提取物和复配剂生产成本低廉，易操作，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产，为微生物工程菌的生长的促进和蛋白诱导表达提供了新的方法。【附图说明】图1是含醛缩酶(Aid)的大肠杆菌工程菌的摇床诱导表达结果比较图，其中，1为加IPTG的蛋白表达情况，2-4为加复配剂的蛋白表达情况； 图2是ω转氨酶在5升发酵罐体系中的表达结果比较图，其中，1为总蛋白，2为上清，Α为加IPTG诱导6小时的蛋白表达情况，B为加复配剂诱导4小时的蛋白表达情况，C为加复配剂诱导5小时的蛋白表达情况，D为加复配剂诱导6小时的蛋白表达情况； 图3是绿色荧光蛋白GFP在5升发酵罐体系中的表达结果比较图，其中，1为加IPTG的蛋白表达情况，2为加IPTG的蛋白表达情况，A为诱导3h，B为诱导4.5h，C为诱导6h，D为诱导8h。【具体实施方式】当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酵母乙醇提取物，其特征在于，由以下方法制备而得，酵母经发酵培养后，对菌体进行收集，菌体经机械破壁处理后，上清液用乙醇沉淀，使上清液中乙醇的浓度为70V%，分离得到沉淀物即为酵母乙醇提取物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昭文，周军，王期，
申请(专利权)人：南京巴傲得生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32