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抗α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂交瘤细胞株制造技术

技术编号:12914748 阅读:100 留言:0更新日期:2016-02-24 20:09
本发明专利技术涉及分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明专利技术通过用牛血清白蛋白BSA与人α-抗胰蛋白酶偶联后的偶联物作为抗原免疫Balb/c小鼠,取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用HAT培养基进行选择性培养,选择出小鼠脾脏细胞与小鼠杂交瘤细胞SP2/0的融合细胞,最后通过ELISA方法鉴定出分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂交瘤细胞株。根据本发明专利技术制备的一株杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC C2015194。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及杂交瘤细胞株及其制备方法,具体地,涉及抗人α-抗胰蛋白酶多克 隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。
技术介绍
α-抗胰蛋白酶(a-antitrysin)又称α-1-蛋白酶抑制剂。它是人类血衆中最 重要的蛋白酶抑制剂,占血浆总蛋白酶抑制能力的90%以上。它能抑制多种丝氨酸内切肽 酶(serineendopeptidase),如中性粒细胞弹性蛋白酶(ΝΕ)、胰蛋白酶、血衆素、凝血酶等, 其主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤,抑制感染和炎症,维持机体内 环境的平衡。血浆中的抗胰蛋白酶主要由肝脏产生,其它如肠、肾、脾等也能产生少量,这些 肝外合成的抗胰蛋白酶在局部组织损伤的调节中起重要作用。α-抗胰蛋白酶是人体内血 清蛋白溶解酶(如胰蛋白酶)的主要抑制物。 蛋白酶-抗蛋白酶系统失衡在肺气肿、肺囊性纤维化(CF)、急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)和急慢性支气管炎等一些炎症性肺疾病的发病机制中起重要作用。抗α-抗胰蛋白 酶是下呼吸道中最主要的蛋白酶抑制剂,为了恢复蛋白酶-抗蛋白酶平衡,抗α-抗胰蛋白 酶替代或补充治疗不仅成为先天性抗α-抗胰蛋白酶缺乏症的主要治疗方法,而且也为其 它炎症性肺疾病的治疗开辟了新的途径。 抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗体除用于基础研究外,还可用于制备高纯品抗人 抗胰蛋白酶及制备抗人α_抗胰蛋白酶检测试剂。抗人α_抗胰蛋白酶凝固活性和抗 原含量检测都可以利用抗人α-抗胰蛋白酶抗体。国内目前尚未见研制人血浆抗α-抗胰 蛋白酶多克隆抗体的报道,也无高纯度抗人α-抗胰蛋白酶产品,而要通过制备高纯品抗 人α-抗胰蛋白酶和抗人α-抗胰蛋白酶检测试剂必须先制备出抗人α-抗胰蛋白酶多隆 抗体。 因而,本领域中存在着对抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的需求。
技术实现思路
为了解决上述问题,本专利技术提供了一种分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂 交瘤细胞株及其制备方法。 在第一个方面,本专利技术提供了一种制备分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂 交瘤细胞株的方法(在本文中有时也简称为"本专利技术的方法"),所述方法包括以下步骤: 1)制备免疫抗原:通过同型双功能蛋白交联剂将人α-抗胰蛋白酶与牛血清白蛋 白偶联,得到人α-抗胰蛋白酶-牛血清白蛋白偶联物; 2)免疫小鼠:采用小剂量多次免疫方案,利用步骤1)中得到的人α-抗胰蛋白 酶-牛血清白蛋白偶联物作用免疫抗原,对Balb/c小鼠进行免疫; 3)细胞融合:将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与步骤2)获得的免疫Balb/c小鼠的脾脏 细胞融合,在含有HAT的RPMI-1640培养基中进行选择性培养; 4)杂交瘤细胞的选择性培养:在步骤3)中融合后的细胞在HAT培养基中选择性 培养后,选择小鼠脾脏细胞与小鼠杂交瘤细胞SP2/0的融合细胞;以及 5)鉴定:检测步骤4)中获得的融合的杂交瘤细胞的培养上清,鉴定分泌抗人 α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂交瘤细胞株。 在第二个方面,本专利技术提供了分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂交瘤细胞 株(下文中有时称为"本专利技术的杂交瘤细胞株"),所述杂交瘤细胞株是通过本专利技术的方法 制备的。 在一个优选的实施方案中,通过本专利技术的方法制备的一株杂交瘤细胞株于2015 年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址为:湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏 中心,保藏编号为CCTCCC2015194,培养物名称为:杂交瘤细胞株α-antitrypsin-P-Ol。【具体实施方式】 定义: "蛋白交联剂"是一类小分子化合物,其分子两端各有一个或者更多个针对特殊基 团(-nh2、-cooh、-hs等)的反应性末端,可以和生物分子上的活性基团分别偶联,从而使这 些分子结合在一起。蛋白交联剂可分为同型双功能交联剂(也称为"同源交联剂")、异型双 功能交联剂(也称为"异源交联剂")和光活化交联剂(也称为"光反应性交联剂")三类。 同型双功能蛋白交联剂的分子两端具有相同的反应性末端或活化反应基团。常用 的同型双功能交联剂在本领域中是公知的,其非限制实例包括但不限于,NHS酯类交联剂诸 如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)和3, 3' -二硫代双 (磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)、琥珀酸辛二酸二亚胺(DSS)和丁二烯-苯乙烯共聚 物(BS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)和Sulfo-DST、双(2-(EGS)和sulfo-EGS、琥 珀酸辛二酸戊二酸盐(DSG)、Ν,Ν'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC);碳二亚胺类诸如1-乙 基-3-碳二亚胺盐酸盐(EDC);亚氨酯类交联剂诸如二甲基二亚胺酯 (DMA)、二甲基亚胺酯(DMP)、二甲基苯二酸亚胺酯(DMS)、二叔丁基过氧化物(DTBP);巯基 反应类交联剂诸如1,4_二(3'-丙酸酰氨基)丁烷(DTOPB);二氟苯衍 生物的1,5-二氟-2, 4-二硝基苯(DFDNB)、双(4-氟-3-硝基苯基)亚砜(DFDNPS)等;光 反应性交联剂类交联剂诸如双-二硫化物(BASED)等; 醛类交联剂诸如甲醛、戊二醛等;双环氧化物类的1,4-丁二醇缩水甘油醛等;酰肼类交联 剂诸如己二酸二酰肼、碳酰肼等;双重衍生物类交联剂诸如被重氮的〇-联甲苯胺、双重氮 联苯胺等;以及双烷基卤化物等。 光反应性交联剂是具有光反应性基团的交联剂。同型双功能交联剂的活化反应基 团也可以是光反应性基团。 表1中列出了部分同型双功能蛋白交联剂的类型、反应基团、蛋白结合基团、光活 化性等性质。 表 1 "抗体"(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下,由B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 本专利技术提供了一种分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制 备方法。 在一个实施方案中,本专利技术的方法包括以下步骤: 1)制备免疫抗原:通过同型双功能蛋白交联剂将人α-抗胰蛋白酶与牛血清白蛋 白偶联,得到人α-抗胰蛋白酶-牛血清白蛋白偶联物; 2)免疫小鼠:采用小剂量多次免疫方案,利用步骤1)中得到的人α-抗胰蛋白 酶-牛血清白蛋白偶联物作用免疫抗原,对Balb/c小鼠进行免疫; 3)细胞融合:将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与步骤2)获得的免疫Balb/c小鼠的脾脏 细胞融合,在含有HAT的RPMI-1640培养基中进行选择性培养; 4)杂交瘤细胞的选择性培养:在步骤3)中融合后的细胞在HAT培养基中选择性 培养后,选择小鼠脾脏细胞与小鼠杂交瘤细胞SP2/0的融合细胞;以及 5)鉴定:检测步骤4)中获得的融合的杂交瘤细胞的培养上清,鉴定分泌抗人 α-抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂交瘤细胞株。 在本专利技术的方法中,可以采用本领域中公知的任意同型双功能蛋白交联剂,优选 碳二亚胺类蛋白交联剂,更优选roc。 在本专利技术中,动物免疫采用小剂量多次免疫方案,以小鼠为例,常规以100~ 200μg/只的剂量免疫,免疫3~4次。一个具体的免疫方案实例是:使用免疫抗原对7周 龄的雌性Balb/c小鼠进行免疫,按100yg/只的免疫剂量,与弗氏完全佐剂按体积比1:1 混合,乳化达到油包水状,将乳化的完全抗原,颈背部多点皮下注射免疫小鼠,2周后,以相 同抗原本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种制备分泌抗人α‑抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法,其特征在于所述方法包括以下步骤:1)制备免疫抗原:通过同型双功能蛋白交联剂将人α‑抗胰蛋白酶与牛血清白蛋白偶联,得到人α‑抗胰蛋白酶‑牛血清白蛋白偶联物;2)免疫小鼠:采用小剂量多次免疫方案,利用步骤1)中得到的人α‑抗胰蛋白酶‑牛血清白蛋白偶联物作用免疫抗原,对Balb/c小鼠进行免疫;3)细胞融合:将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与步骤2)获得的免疫Balb/c小鼠的脾脏细胞融合,在含有HAT的RPMI‑1640培养基中进行选择性培养;4)杂交瘤细胞的选择性培养:在步骤3)中融合后的细胞在HAT培养基中选择性培养后,选择小鼠脾脏细胞与小鼠杂交瘤细胞SP2/0的融合细胞;以及5)鉴定:检测步骤4)中获得的融合的杂交瘤细胞的培养上清,鉴定分泌抗人α‑抗胰蛋白酶多克隆抗体的杂交瘤细胞株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:张明徽
申请(专利权)人:清华大学
类型:发明
国别省市:北京;11

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