本发明专利技术公开了一种从人血浆组分冷沉淀中制备高纯人凝血因子VIII的方法，包括如下步骤：(1）冷沉淀的溶解；(2）氢氧化铝凝胶吸附与压滤；(3）S/D病毒灭活；(4)阴离子交换树脂柱层析；(5）疏水柱层析；(6）超滤透析及浓缩；(7）加稳定剂及效价调节；(8）纳米膜除病毒过滤；(9）除菌过滤及分装；(10）冻干；(11）干热病毒灭活。本发明专利技术采用两步柱层析工艺纯化人凝血因子VIII，制得高纯度的产品，比活可达3OO IU/mg左右，远高于传统工艺约50 IU/mg的水平，产品的外观及热稳定性明显改善；制备过程中采用三种病毒灭除方式使产品的临床使用安全性大大提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物制药领域，涉及一种血液制品的制备，具体讲是涉及一种高纯人凝 血因子VIII的制备方法。
技术介绍
人凝血因子VIII(FVIII)是人体最重要的凝血因子之一，在肝脏中合成，有 2332个氨基酸残基，由两条肽链所组成，重链分子量为90-200kDa;轻链分子量为80kDa， 二条肽链间由Ca2+连接。在人体内的半衰期8-12小时，血浆中的含量仅为0. 05-0.lmg/L。 FVIII缺乏会引起凝血障碍，导致甲型血友病发生，它是FVIII编码基因突变导 致该凝血因子功能缺陷所致的一种凝血功能障碍性遗传病，呈X连锁隐性遗传，由女性传 递，男性发病，全球发病率15-20人/ 10万人，中国发病率约2-3人/ 10万人。该病的主 要症状是轻微损伤或小手术后有长时间出血倾向。出血表现以下几个方面，皮肤、粘膜 出血，幼儿亦常见于头部碰撞后出血和血肿；2，关节积血，表现为复发性关节出血及血友 病性关节病，是血友病最常见的临床表现之一，多见于膝关节，其次为踝、髋、肘、肩关节等 处；3，肌肉出血和血肿；4，创伤或手术后出血；5，其他部位的出血如脏器与颅内；另外， 三分之二的患者出现血尿。甲型血友病属遗传性疾病，目前只能通过输注FVIII制剂进行 替代性治疗，但只要定期输注Fill制剂，甲型血友病患者完全可以像正常人一样生活。国 外重组人凝血因子VIII于2007年已进入中国市场，但其昂贵的价格让普通患者望而却 步，而且，也有越来越多的临床数据显示，频繁注射重组人凝血因子VIII的患者体内会产 生抑制物，使得凝血效果明显下降。 国内目前血制品公司供应临床的FVIII产品数量十分有限，难以满足国内甲型血 友病患者的使用要求。究其原因，主要是传统的FVIII生产工艺不稳定，导致产品得率低， 另外由于杂蛋白含量偏高，FVIII比活低，产品不稳定，外观差，热稳定性不好，常导致产品 报废。 本专利技术开发了一种从冷沉淀中分离纯化FVIII的新方法，优化了制备工艺的参 数，特别是采用了两步层析纯化工艺，克服了目前生产工艺普遍存在的比活低（一般低于 50IU/mg)、得率低（一般低10万IU/吨血浆）及产品外观较差(冻干粉复溶液有析出物，乳 光明显）的缺点，具有比活高、质量稳定，合格率高的优点，可以大规模进行生产。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种工艺稳定、产品合格率高、质量优良及使 用安全的人凝血因子VIII的制备方法。 -种高纯人凝血因子VIII的制备方法，包括如下步骤： (1 )冷沉淀溶解：按1:4-10的重量比，将冷沉淀投入预先配制的溶解缓冲液中， 温度控制在15_30°C，搅拌1. 5-3小时，使其充分溶解； (2 )氢氧化铝凝胶吸附与压滤：步骤（1)所得到的溶解液中加入A1(0H)3凝胶，充 分搅拌0. 5-1. 5小时，然后用颇尔公司生产的Supradur50P滤板串联1.ΟμL?滤芯压滤， 收集澄清滤液，过滤前用步骤（1)所述溶解缓冲液预洗滤板及滤芯； (3 )S/D病毒灭活：步骤（2)所收集的滤液中加入Tween80至1.0% (wt%)，ΤΝΒΡ(磷酸三丁酯）至〇. 3% (wt% )，搅匀后升温至24-26°C，后保温6-8小时，然后用0. 45μm 滤芯澄清过滤，收集滤液； (4 )阴离子交换柱层析：步骤（3)所收集的滤液上阴离子交换柱，柱子预先用平衡 缓冲液A充分平衡，上柱结束后，用平衡缓冲液A冲洗柱子，后用洗涤缓冲液A洗涤柱子， 再用洗脱缓冲液A洗脱柱子，收集洗脱液即为纯化的FVIII溶液，及时用0.45μm滤芯进 行过滤，收集滤液； (5 )疏水柱层析：步骤（4)所收集的滤液中加入氯化钠至1.8M-2.0M，然后上疏 水柱，柱子预先用平衡缓冲液B充分平衡，上柱结束后用平衡缓冲液B冲洗柱子，后用洗 涤缓冲液B洗涤柱子，再用洗脱缓冲液B洗脱柱子，收集洗脱液即为高纯FVIII溶液；用 0. 45μm或0. 22μm滤芯过滤以上洗脱液； (6 )超滤：用超滤膜包浓缩以上滤液，然后恒体积透析5-7倍，再浓缩至凝血FVIII效价高于35IU/ml;后移出超滤膜包并后洗膜包； (7 )加稳定剂及调节：将FVIII含量稀释至所需值(一般规格为20-30IU/ml)，加 入稳定剂，后调PH值至6. 50-7. 50 ; (8 )纳米膜除病毒过滤：用0. 1μπι滤芯串联15-20纳米滤芯进行除病毒过滤； (9 )除菌过滤及分装：用0. 22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装； (10 )冻干； (11 )干热病毒灭活：在100°c沸水浴中保温0.5-1小时，进行干热病毒灭活。 步骤⑴所述的溶解缓冲液由TRIS(三羟甲基氨基甲烷)、氯化钠、甘氨酸、 肝素钠及水组成，所述的溶解缓冲液中TRIS的浓度为0. 01M-0. 02M，氯化钠的浓度为 0. 1M-0. 15M，甘氨酸的浓度为0. 5-1. 5%(wt%)，肝素钠的加入量为2000-8000IU/升，所 述的溶解缓冲液的PH值为6. 50-7. 50。 步骤（2)所述的氢氧化铝凝胶的加入量为80-160克/千克悬浮液。步骤（4)所述的阴离子交换柱充填的树脂为DEAESepharoseFF、CaptoDEAE、 QsepharoseFF、CaptoQ及QSepharoseHP中的任意一种；所述的平衡缓冲液A、洗涤 缓冲液A及洗脱缓冲液A均由柠檬酸钠、氯化钠、甘氨酸、氯化钙及水组成；所述的平衡缓 冲液A中，柠檬酸钠的浓度为0. 01M-0. 02M，氯化钠的浓度为0. 075M-0. 15M，甘氨酸的浓 度为0. 5-1. 5%，氯化钙的浓度为0. 005M-0. 015M，PH值为PH6. 50-7. 50 ;所述的洗涤缓 冲液A中，柠檬酸钠的浓度为0. 01M-0. 02M，氯化钠的浓度为0. 2M-0. 3M，甘氨酸的浓度 为0. 5-1.5%(wt%)，氯化钙的浓度为0. 005M-0. 015M，PH值为PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脱 缓冲A液中，柠檬酸钠的浓度为0. 01M-0. 02M，氯化钠的浓度为0. 5M-2. 0M，甘氨酸的浓 度为 0. 5-1. 5%(wt%)，氯化钙的浓度为 0. 001M-0. 005M，PH值为PH6. 50-7. 50。步骤（5)所述的疏水柱的填料为CaptoPhenyl(LS)，PhenylSepharose 6FF(LS)，OctylS印harose4FF中的任意一种；所述平衡缓冲液B、洗涤缓冲液B均由 柠檬酸钠、氯化钠、甘氨酸、氯化钙及水组成；所述的平衡缓冲液B中，柠檬酸钠的浓度为 0. 01M-0. 02M，氯化钠的浓度为1. 8M-2M，甘氨酸的浓度为0. 5-1. 5%(wt%)，氯化钙的浓 度为0.01M-0.02M，PH值为PH6. 50-7. 50 ;所述的洗涤缓冲液B中，柠檬酸钠的浓度为 0. 01M-0. 02M，氯化钠的浓度为0. 6M-1. 6M，甘氨酸的浓度为0. 5-1. 5%(wt%)，氯化钙的浓 度为0.01M-0.02M，PH值为PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液B由柠檬酸钠、甘氨酸、氯 化钙及水组成；所述的洗脱缓冲本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高纯人凝血因子VIII 的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)冷沉淀溶解按1:4‑10 的重量比，将冷沉淀投入预先配制的溶解缓冲液中，温度控制在15‑30℃ ，搅拌1.5‑3小时，使其充分溶解；(2)氢氧化铝凝胶吸附与压滤步骤（1）所得到的溶解液中加入Al(OH)3 凝胶，充分搅拌0.5‑1.5小时，然后用颇尔公司生产的Supradur 50P 滤板串联1.0μm 滤芯过滤，收集澄清滤液，过滤前用步骤（1）所述溶解缓冲液预洗滤板及滤芯；(3) S/D 病毒灭活 步骤（2）所收集的滤液中加入Tween80 至1.0% (wt%) , TNBP （磷酸三丁酯）至0.3% (wt%) ，搅匀后升温至24‑26℃ ，后保温6‑8小时，然后用0.45μm 滤芯澄清过滤，收集滤液；(4)阴离子交换柱层析步骤（3）所收集的滤液上阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液A 充分平衡，上柱结束后，用平衡缓冲液A 冲洗柱子，后用洗涤缓冲液A 洗涤柱子，再用洗脱缓冲液A 洗脱柱子，收集洗脱液即为纯化的FVIII 溶液，及时用0.45μm 滤芯进行过滤，收集滤液；(5)疏水柱层析步骤（4）所收集的滤液中加入氯化钠至1.8M‑2.0M ，然后上疏水柱，柱子预先用平衡缓冲液B 充分平衡，上柱结束后用平衡缓冲液B 冲洗柱子，后用洗涤缓冲液B 洗涤柱子，再用洗脱缓冲液B 洗脱柱子，收集洗脱液即为高纯FVIII 溶液；用0.45μm 或0.22μm 滤芯过滤以上洗脱液；(6)超滤用超滤膜包浓缩以上滤液，然后恒体积透析5‑7 倍，再浓缩至FVIII 效价高于35IU/ml； 后移出超滤膜包并后洗膜包； (7)加稳定剂及调节将FVIII 效价调至所需值（一般规格为20‑30IU/ml)，加入稳定剂，后调PH 值至6.50‑7.50；(8)纳米膜除病毒过滤用0.1μm 滤芯串联15‑20 纳米滤芯进行除病毒过滤； (9)除菌过滤及分装 用0.22μm 滤芯对产品进行除菌过滤并分装； (10)冻干； (11)干热病毒灭活 在100℃ 沸水浴中保温0.5‑1小时，进行干热病毒灭活。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李春洲，
申请(专利权)人：上海洲跃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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