一种凝乳酶的贮藏方法及可常温储存的凝乳酶液技术

本发明专利技术公开了一种凝乳酶贮藏方法及可常温贮藏的凝乳酶液。所述贮藏方法包括以下步骤：取CaCl2加入凝乳酶液中混合，所述凝乳酶液由保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清中提取得到。所述凝乳酶液包括CaCl2和凝乳酶，所述凝乳酶由BD3526发酵液上清中提取得到。本发明专利技术所述的凝乳酶的贮藏方法简单易行，首次实现了在常温范围内，对类芽孢杆菌所产凝乳酶活性的保护；本发明专利技术提供的可常温贮藏的凝乳酶液适合常温贮藏，便于工厂化实际操作，且实施效果显著，有效提高了类芽孢杆菌BD3526产的凝乳酶酶活保留率，为在常温条件下保存通过类芽孢杆菌发酵制备的凝乳酶制剂提供了可行性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种凝乳酶的贮藏方法以及一种可常温贮藏 的凝乳酶液。
技术介绍
众所周知，酶作为一种生物催化剂，其半衰期短、易失活这些不足将严重影响着酶 的使用效果。这些不足产生很大程度上是由于酶存在自身降解的现象，有研究报道，由细 菌产生的中性蛋白酶存在自身降解的现象。这一现象不仅影响酶类的结构鉴定，而且导致 酶活降低甚至消失，对酶类的分离纯化、保存及生产应用带来困难，凝乳酶的应用也存在同 样的困境。所以，如何提高凝乳酶的储存稳定性，尤其是如何在常温保证凝乳酶的活力，从 而扩大酶的应用范围成为当今国内外亟待解决的难题。这也要求我们探索一种新的贮藏方 法，能在常温条件下有效地抑制凝乳酶的自身降解，从而实现凝乳酶常温下的有效贮藏。 微生物来源的凝乳酶以其产量大、成本较低、方便提取、不受地域影响的优势，越 来越广泛的应用于干酪工业化生产。国外一些公司已利用改良的菌种生产出高活力的凝乳 酶，创造了巨大的经济效益，而我国干酪生产中使用的凝乳酶绝大部分尚依赖进口。因为目 前为止，国内虽然已有大量研究筛选不同来源的高产凝乳酶的菌株、优化菌种发酵条件及 分离纯化条件，并分析其酶学性质，但如何在常温下贮藏凝乳酶，并有效保存凝乳酶的活性 尚且在探索之中，成为长期困扰国内公司的难题，造成现阶段国内生产的凝乳酶无法走向 市场，无法被有效利用。 在工业化酶制剂中，贮藏中凝乳酶的稳定性是开发应用中一个关键因素。酶的稳 定性不仅仅可以影响酶的货架期，而且可以影响到酶的作用时间。常温条件下，凝乳酶稳定 性提高，除了贮藏时间延长，便于运输销售之外，更能延长酶作用时间，提高生产效率，从而 有效地降低生产成本。当前，提高酶稳定性主要的方法有：蛋白质工程、化学修饰、酶的固定 化和添加保护剂等。在液体酶中直接加入保护剂是一种常用的经济、有效的方法。 可产生一定活力的凝乳酶的微生物包括放线菌中链霉菌属、根霉、毛霉、粟疫菌及 其他通过基因工程或辐照获得的高产凝乳酶的菌株等。中国专利申请CN103740618A公开 的类芽孢杆菌属的一个新菌种Paenibacillusdamxungensissp.ηον·(保藏编号为：CGMCC No. 8333)，即类芽孢杆菌BD3526菌株，该菌株发酵液具有一定的凝乳活力，经过提取即可 得到凝乳酶。通过麸皮培养BD3526发酵制备的凝乳酶，在常温贮藏过程中极易失活，半衰 期短，如初始凝乳酶活8000SU/mL的溶液，其酶活半衰期约为30min，且失活时间与初始凝 乳酶活具有相关性。因为通过类芽孢杆菌发酵产生的凝乳酶在常温保存十分困难，从而制 约类芽孢杆菌BD3526发酵产生的凝乳酶在干酪工业化生产中的应用，因此，开发一种利用 保护剂来维持类芽孢杆菌凝乳酶稳定性的贮藏方法既经济，操作又方便，适合大规模应用， 正是国内相关产业所急需的，高效方便的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有常温贮藏过程中，类芽孢杆菌BD3526所产 凝乳酶存在的自身降解，极易失活，半衰期短，不能常温贮藏等缺陷，提供了一种凝乳酶的 贮藏方法及可常温贮藏的凝乳酶液，该贮藏方法能在常温下有效保存类芽孢杆菌BD3526 所产凝乳酶的活性，从而保证了类芽孢杆菌所产凝乳酶的后续有效利用。 本专利技术人经过广泛的研究和反复的试验，发现通过改变类芽孢杆菌所产凝乳酶液 中钙离子浓度，能够长久的维持凝乳酶活力。进一步地，发现类芽孢杆菌所产凝乳酶在钙离 子溶液中，在常温条件下保存，即可长久的维持凝乳酶活力，从而完成了本专利技术。 为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之一是，一种凝乳酶的贮藏方法， 所述贮藏方法包括以下步骤：取CaCl2加入凝乳酶液中混合，所述凝乳酶液由保藏编号为 CGMCCNo. 8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清中提取得到。 本专利技术中，所述混合是本领域常规的方法，较佳地为经搅拌混合均匀。 本专利技术中，所述凝乳酶液较佳地由麸皮培养基培养保藏编号为CGMCCNo. 8333的 类芽孢杆菌BD3526发酵液上清中提取得到。所述由麸皮培养基培养培养条件为常规培养 条件（详见公开号为CN103865842A的中国专利申请），较佳地采用摇床震荡培养，震荡速度 为常规的，较佳的为160r/min，培养温度为常规的，较佳地为20°C~40°C，更佳地为25°C~ 35°C，最佳地为30°C，培养时间较佳的为72小时（h)。所述麸皮培养基为常规的，较佳包括 小麦麸皮和水，其中小麦麸皮的含量较佳为1 %~14 %，更佳地为2 %~5 %，最佳地为3 %， 所述百分比为质量百分比。 本专利技术所述小麦麸皮培养基的主要成分较佳地为：蛋白质13. 9~18. 6%，脂肪 3. 3~8. 2 %，总碳水化合物61. 9~74. 62 %，水分4. 8~18. 02 %，灰分3. 38~6. 50 %，所 述百分比为质量百分比（详见公开号为CN103865842A的中国专利申请）。 本专利技术中，所述凝乳酶液提取方法为常规的，较佳地为利用硫酸铵沉淀法从由麸 皮培养基培养的保藏编号为CGMCCNo. 8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清中提取而来。 本专利技术中，所述CaCl2可由常规方法制备，优选地由包括以下步骤的方法制备而 得：取CaCl^体粉末，并使用去离子水进行溶解，制备得到的不同浓度的CaCl2溶液，即可 作为金属蛋白酶保护剂（可简称金属酶保护剂），用于维持类芽孢杆菌BD3526所产凝乳酶 (一种金属蛋白酶）的稳定性，保护类芽孢杆菌所产凝乳酶的活性。 本专利技术所述贮藏方法中，所述混合后0&(：12的浓度较佳地为2. 5~100mm〇l/L，更 佳地为50~100mmol/L，最佳地为50~75mmol/L。 本专利技术所述的贮藏方法的贮藏温度较佳的在0~40°C范围内，即可保证酶活力维 持较高水平，更佳的贮藏温度为4~40°C，最佳地为4~25°C。 本专利技术所述贮藏方法可长时间维持类芽孢杆菌所产凝乳酶活力，较佳的维持时间 为0~720小时。 本专利技术所述的类芽孢杆菌凝乳酶的贮藏方法的一较佳的实例包括以下步骤： 1)将保藏编号为CGMCCNo. 8333的类芽孢杆菌BD3526接种于麸皮培养基进行发 酵，得发酵液； 2)利用硫酸铵沉淀方法，提取步骤1)所述的发酵液的上清中的凝乳酶，获得类芽 孢杆菌凝乳酶液； 3)取0&(：12固体粉末，用去离子水溶解，获得CaCl2溶液，即为金属蛋白酶保护剂； 4)将步骤3)所述的金属蛋白酶保护剂加入步骤2)所述的类芽孢杆菌凝乳酶液 中，搅拌均匀，贮藏于常温下即可。 为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之二是，一种可常温贮藏的凝乳酶 液，所述可常温贮藏的凝乳酶液包括CaCljP凝乳酶，所述类芽孢杆菌凝乳酶由保藏编号 为CGMCCNo. 8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清中提取得到。 本专利技术中，所述的可常温贮藏的凝乳酶液还可以包括常规的载体，包括水，或者 PBS，或者生理盐水等。 本专利技术中，所述凝乳酶较佳的制备方法同上述凝乳酶液的制备方法。 本专利技术中，所述的CaCl2的浓度较佳为2. 5~100mmol/L，更佳地为50~lOOmmol/ L，最佳地为50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凝乳酶的贮藏方法，其特征在于，所述贮藏方法包括步骤如下：取CaCl2加入凝乳酶液中混合，所述凝乳酶液由保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清中提取得到。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杭锋，王钦博，陶源，刘振民，陈卫，洪青，穆海菠，王国骄，雍靖怡，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31