本发明专利技术属于生物技术领域，具体为一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法。本发明专利技术方法步骤为，首先合成纳米金修饰的石墨烯（G@PDA@Au），再对氨基封闭后的蛋白进行酶解，对酶解液进行巯基衍生后，利用G@PDA@Au对衍生上巯基的非N末端肽段进行去除，最后利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行蛋白质N末端的检测。本发明专利技术方法可以方便高效地去除非N末端肽段，提高蛋白质N末端肽段鉴定效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用纳米金修饰的材料用于蛋白质N末端分离的方法。
技术介绍
蛋白质N末端的氨基酸起点常与数据库中的起始位点不同。蛋白质在翻译和加工过程中，N端可能涉及到RNA的剪切，多种可选的翻译起点，信号肽的切割，以及各种化学层面的翻译后修饰等过程，而导致蛋白质N末端的复杂性。鉴定蛋白质N末端序列对于理解蛋白质的生物功能等具有重要意义。目前，蛋白质N末端的方法主要基于正向富集和反向去除策略。正向富集策略的主要原理是先在蛋白质N末端引入特异性基团，经胰蛋白酶酶切后，蛋白变成肽段，再利用相应的材料对蛋白质N末端进行特异性地分离。反相去除策略主要原理是先在蛋白质层面进行所有的氨基全封闭，经过胰蛋白酶酶切后，蛋白变成肽段，再利用非N末端肽段上的游离氨基，结合氨基反应材料去除非N末端肽段，并对蛋白质N末端肽段进行分离富集。反相去除方法相较正向富集方法，有望富集到更多因化学修饰而导致游离氨基封闭的N末端，然而，去除材料的效率相对略有不足。因此，许多研究合成不同的可离去基团修饰的材料，包括三氟乙磺酸基材料等，利用氨基的亲核性对非N末端肽段进行去除。为进一步提高非N末端肽段去除效率，需要探索更高效的去除材料。有文献表明，利用特劳特试剂(Traut’s Reagent)可以对氨基进行高效快速的巯基衍生，而同时，利用金和硫可以在温和的条件下形成牢固的金硫键。巯基衍生和金硫键形成均为加成反应，因此，体系中不会引入多余的盐类，减少除盐过程中样品损失，且不影响质谱的鉴定。若体系中的非N末端肽段可以得到高效的巯基衍生并被金修饰的材料分离，则可以实现蛋白质N末端的高效分离鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法。本专利技术提供的纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法，具体步骤为: 首先，合成纳米金修饰的石墨稀(GOPDAOAu)； 然后，对蛋白上的所有游离氨基进行封闭，再对封闭蛋白进行溶液酶解； 然后，用特劳特试剂对非N末端肽段进行巯基衍生，加入纳米金修饰的石墨烯对含巯基的非N末端肽段进行分离富集； 最后，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-ToF)进行蛋白质N末端的检测。本专利技术中，所述合成纳米金修饰的石墨稀的具体步骤如下: (1)取一定质量石墨烯分散在10 mM Tris-HCl中，再加入4_10重量的多巴胺，室温下搅拌4-12 h ; (2)将多巴胺包覆的石墨烯(GOPDA)经离心后，用水和乙醇交替洗涤数次，再在真空下烘干4-16 h ; (3)取一定质量G0PDA分散在50-100ml水中，加入终浓度为0.1-0.5 mM无水合氯金酸，加热至85-90°C后，加入5-10 mM柠檬酸三钠，保持加热1小时以上(一般为1_2小时)，经离心，用水和乙醇交替洗涤数次后，用真空干燥，得到纳米金修饰的石墨烯。本专利技术中，所述对蛋白上的所有游离氨基进行封闭，再对封闭蛋白进行溶液酶解的具体步骤日下； (4)将蛋白溶于高浓度(一般为4Μ以上，如为4 Μ-10Μ)盐酸胍中，用等体积40-100 mM三乙胺碳酸氢盐稀释后，5-8 mM 二硫苏糖醇，60°C以上(一般为60-80°C )反应至少0.5小时(一般为0.5-1小时)后，再加入2-2.5倍浓度(相较于二硫苏糖醇)的碘乙酰胺，闭光反应0.5-1小时，再加入20-60 mM甲醛和10-30 mM氰基硼氢化钠反应4_16小时； (5)用三乙胺碳酸氢盐(pH7.2-8.5)对蛋白进行溶液置换，并重复2次以上(一般为2-3次)置换动作，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶的加入量为蛋白的2.5%-5%，进行过夜酶解； 本专利技术中，所述用特劳特试剂对非N末端肽段进行巯基衍生，加入纳米金修饰的石墨烯对含巯基的非N末端肽段进行分离富集的具体步骤为； (6)取一单位质量蛋白酶解液加入0.2-20倍单位质量特劳特试剂，20-60°C下反应0.5小时以上或过夜； (7)在上述混合液中加入200-600倍质量的GOPDAOAu，20-60°C下反应1.5-2.5 h，取上清液。最后进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析鉴定。本专利技术中，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析与常规分析相同，具体步骤为，取0.1 yg蛋白酶解液于革巴板上，再在蛋白革巴点上添加1 yL 4 mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质，待液体干燥后，进入机器进行分析。利用本专利技术方法可以实现蛋白质N末端肽段高效快速地分离。【附图说明】图1为GOPDAOAu透射电镜图。图2为实验流程示意图。图3为人血浆白蛋白经氨基封闭后酶解液非N末端肽段去除前后MALD1-ToF图。【具体实施方式】实施例1: 一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法，具体步骤如下: (1)取一定质量石墨烯分散在10mM Tris-HCl中，再加入4_10重量的多巴胺，室温下搅拌4-12 h ; (2)将多巴胺包覆的石墨烯(G0PDA)经离心后，用水和乙醇交替洗涤数次，再在真空下烘干4-16 h ; (3)取一定质量G0PDA分散在50-100ml水中，加入0.25 mM无水合氯金酸，加热至85°C后，加入10 mM柠檬酸三钠，保持加热1 h后，经离心，用水和乙醇交替洗涤数次后，用真空干燥待用； (4)将人血浆白蛋白溶于6Μ盐酸胍中，用等体积50 mM三乙胺碳酸氢盐稀释后，5 mM二硫苏糖醇，60°C反应45分钟后，再加入12.5 mM的碘乙酰胺，闭光反应一小时，再加入40mM甲醛和20 mM氰基硼氢化钠反应6小时； (5)用25mM三乙胺碳酸氢盐对蛋白进行溶液置换，并重复2次置换动作，加入2.5%胰蛋白酶，进行过夜酶解； (6)取10μ g蛋白酶解液加入0.5倍质量特劳特试剂，60°C下反应1.5 h ; (7)在上述混合液中加入200-400倍质量的G@PDA@Au，60°C下反应2.5 h，取上清液，进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析鉴定，得到人血浆白蛋白N末端肽段1205.5 Da0实施例2: 一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法，具体步骤如下: (1)取一定质量石墨烯分散在10mM Tris-HCl中，再加入4_10重量的多巴胺，室温下搅拌4-12 h ; (2)将多巴胺包覆的石墨烯(G0PDA)经离心后，用水和乙醇交替洗涤数次，再在真空下烘干4-16 h ; (3)取一定质量G0PDA分散在50-100ml水中，加入0.25 mM无水合氯金酸，加热至85°C后，加入10 mM柠檬酸三钠，保持加热1 h后，经离心，用水和乙醇交替洗涤数次后，用真空干燥待用； (4)将牛血浆白蛋白溶于6Μ盐酸胍中，用等体积50 mM三乙胺碳酸氢盐稀释后，5 mM二硫苏糖醇，60°C反应45分钟后，再加入12.5 mM的碘乙酰胺，闭光反应一小时，再加入40mM甲醛和20 mM氰基硼氢化钠反应6小时； (5)用25mM三乙胺碳酸氢盐对蛋白进行溶液置换，并重复2次置换动作，加入2.5%胰蛋白酶，进行过夜酶解； (6)取10μ g蛋白酶解液加入0.5倍质量特劳特试剂，60°C下反应1.5 h ; 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质N末端分离的方法，其特征在于，具体步骤为：首先，合成纳米金修饰的石墨烯；然后，对蛋白上的所有游离氨基进行封闭，再对封闭蛋白进行溶液酶解；然后，用特劳特试剂对非N末端肽段进行巯基衍生，加入纳米金修饰的石墨烯对含巯基的非N末端肽段进行分离富集；最后，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行蛋白质N末端的检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张祥民，李兰婷，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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