本发明专利技术提供一种利用线粒体分子标记快速鉴定中黑苜蓿盲蝽中部地区和边沿地区种群的方法，特别是对鄂冀种群以及甘黔种群进行鉴别。本发明专利技术根据中黑苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I(COI)、细胞色素b(Cytb)、线粒体NADH脱氢酶亚基5(ND5)三个基因分别设计特异性引物，然后将PCR扩增产物进行串联比对，从而实现对我国中部地区和边沿地区中黑苜蓿盲蝽种群的鉴定。该方法简单可靠，可操作性强，稳定性好，可重复性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用线粒体分子标记鉴定中黑 苜蓿盲蝽种群的方法。
技术介绍
中黑苜蓿盲蝽作为棉田重要的害虫种类之一，尤其是近十年来，随着转基因棉花 的大量种植，伴随着化学农药的减少使用，该虫已经从次要害虫上升为主要害虫，特别是我 国的长江流域和黄河流域棉区呈急剧上升趋势。中黑苜蓿盲蝽种群数量在中国大范围内的 明显增加和空间范围的大量扩张给防治工作带来很大挑战。 大量的研究表明中黑苜蓿盲蝽虽然在中国大部分地区分布危害，但该昆虫的外部 形态特征在不同地理种群间差异并不明显，很难进行区分，因此通过外部形态特征实现不 同地区种群的鉴定是非常困难的。线粒体基因在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等 突变，同时严格遵守母系遗传，进化速率快，能够在短时间内完成谱系分化，因此利用线粒 体分子标记对中黑苜蓿盲蝽中部地区和边沿地区种群进行鉴定是一种非常可靠的分子生 物学方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用线粒体分子标记快速鉴定中黑苜蓿盲蝽中部地区 和边沿地区种群的方法，特别是对鄂冀种群以及甘黔种群进行鉴别。 为了实现本专利技术目的，本专利技术提供用于鉴定中黑苜蓿盲蝽种群的PCR引物组合， 所述引物组合包括PCR扩增中黑苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I基因 C0I的引物对（1)、 扩增细胞色素 b基因 Cytb的引物对（2)以及扩增线粒体NADH脱氢酶亚基5基因 ND5的引 物对（3);引物序列如下： (l)Ap-COI-F :5' - CGAATTAGGAATACCAGGATCATTC - 3' Ap-COI-R :5' - CAAATCCTGGTAGGATTAGAATATA - 3' (2)Ap-Cytb-F:5, -GACCAAGAAGGATTTCATTATGATG-3' Ap-Cytb-R :5' - CGTGCTCCAATTCAAGTTAATAAGA - 3' (3)Ap-ND5-F :5, - TAGTCATTCTTATATACAGGATGAT - 3' Ap-ND5-R : 5, - GGTAAACCAGATAAAGAAAAAGACG - 3， 本专利技术还提供含有所述引物组合的用于鉴定中黑苜蓿盲蝽种群的PCR检测试剂 盒。 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳 性模板等中的至少一种。 本专利技术还提供，包括以下步 骤： 1)提取待测中黑苜蓿盲蝽的基因组DNA ; 2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用引物对（1)、（2)、（3)分别进行PCR扩增 反应； 3)纯化并分析PCR产物。 PCR反应体系以25μ1 计为：5XPCR反应缓冲液5yL，10mM dNTPs 0.5yL，5U/yl Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，10 μ Μ上、下游引物各1 μ L，模板DNA 2 μ L，无菌水定容至25 μ L。 PCR 扩增程序为：94°C预变性 3min ;94°C变性 30s，55°C退火 30s、72°C延伸 lmin， 35个循环；72°C延伸5min，4°C保存。 前述的方法，步骤3)中分别对PCR产物进行纯化和测序后，将测序结果按照 C0I-Cytb-ND5串联拼接，串联序列大小为2046bp，鄂冀种群第174、186、258、288、525、579、 1053、1134、1398、1632、1361、1569、1713、2001bp 处碱基依次为 C、C、A、A、C、C、C、C、C、C、 T、T、T、A，甘黔种群第 174、186、258、288、525、579、1053、1134、1398、1632、1361、1569、1713、 2001bp处碱基依次为T、T、G、G、T、T、T、T、T、T、C、C、C、G。将上述位点作为分子标记，从而 实现对我国中部地区和边沿地区中黑苜蓿盲蝽种群，特别是鄂冀种群（湖北和河北）以及 甘黔种群（甘肃和贵州）的鉴定。 本专利技术提供的分子鉴别方法简单可靠，可操作性强，稳定性好，可重复性强。【附图说明】 图1为本专利技术实施例1中中黑苜蓿盲蝽鄂冀种群和甘黔种群的线粒体分子标记细 胞色素氧化酶I (C0I)、细胞色素 b (Cytb)、线粒体NADH脱氢酶亚基5 (ND5)三个基因的串联 序列比对结果；其中，表示相同的碱基位点，HBZJ :湖北枝江；HBLF :河北廊坊；GSLN :甘 肃陇南；GZGY :贵州贵阳。【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 实施例1利用线粒体分子标记快速鉴定中黑苜蓿盲蝽鄂冀种群以及甘黔种群的 方法 (1)采集湖北、河北、甘肃和贵州的中黑苜蓿盲蝽个体，提取全基因组DNA 中国的中部和边沿地区分别选取代表种群，即在中部地区的湖北，河北和边沿地 区的贵州，甘肃地区采集中黑苜蓿盲蝽个体。中黑苜蓿盲蝽的野外采集采用网捕法，利用吸 虫管收集成虫，再将成虫放入无水乙醇中，然后带回实验室内，采用体式解剖镜进一步对成 虫形态特征进行鉴定确认，确保种类鉴定正确无误。 提取基因组DNA时，将成虫腹部和翅去除，剩余组织结构作为试验材料，采用天根 生化科技有限公司生产的TIANamp Genomic DNA试剂盒提取因组DNA。具体操作步骤参考 其说明书。 (2)设计并合成中黑苜蓿盲蝽三种线粒体分子标记的特异性引物 利用Primer Primer5软件分别设计适合中黑苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶 I (C0I)、细胞色素 b (Cytb)、线粒体NADH脱氢酶亚基5 (ND5)基因的特异性引物。弓丨物序列 如下： (l)Ap-COI-F :5' - CGAATTAGGAATACCAGGATCATTC - 3' Ap-COI-R :5' - CAAATCCTGGTAGGATTAGAATATA - 3' (2)Ap-Cytb-F:5, -GACCAAGAAG当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于鉴定中黑苜蓿盲蝽种群的PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括PCR扩增中黑苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I基因的引物对(1)、扩增细胞色素b基因的引物对(2)以及扩增线粒体NADH脱氢酶亚基5基因的引物对(3)；引物序列如下：(1)Ap‑COI‑F：5'–CGAATTAGGAATACCAGGATCATTC–3'Ap‑COI‑R：5'–CAAATCCTGGTAGGATTAGAATATA–3'(2)Ap‑Cytb‑F：5'–GACCAAGAAGGATTTCATTATGATG–3'Ap‑Cytb‑R：5'–CGTGCTCCAATTCAAGTTAATAAGA–3'(3)Ap‑ND5‑F：5'–TAGTCATTCTTATATACAGGATGAT–3'Ap‑ND5‑R：5'–GGTAAACCAGATAAAGAAAAAGACG–3'。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张利娟，崔金杰，张帅，雒珺瑜，王春义，吕丽敏，李春花，朱香镇，王丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41
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