一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法技术

技术编号:12814817 阅读:65 留言:0更新日期:2016-02-07 08:41
本发明专利技术公开了一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法,涉及植物病原菌分离技术领域。本方法是:①病原菌的分离;②病原菌的培养;③病原菌的菌落PCR检测;④病原菌的分子鉴定。本发明专利技术实现了猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定,具有操作简单、灵敏性高和特异性强等特点,且检测结果准确、客观,对提高猕猴桃溃疡病菌的检测效率及灵敏度具有重要意义;适用于准确检测猕猴桃种苗、亲本资源和育种中间材料在生长早期是否含有猕猴桃溃疡病菌,将有效推动猕猴桃的科研、育种及生产,具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及植物病原菌分离
,尤其设及一种雜猴桃溃瘍病感病样本的快 速鉴定方法。
技术介绍
雜猴桃具有很高的营养及经济价值,是当今世界发展最为迅速的水果。我国是世 界雜猴桃起源和分布中屯、,拥有丰富的雜猴桃种质资源,目前已超越新西兰及意大利成为 世界雜猴桃栽培面积和产量最大的国家。雜猴桃产业对农民增收和产业结构调整具有重要 意义。 雜猴桃溃瘍病是一种由下香假单胞杆菌雜猴桃致病变种(Pseudomonassyringae pv.Actinidiae,简称Psa)引起的细菌性病害。该病自1983年在日本首次被发现W来,现 已在新西兰、意大利、中国、法国、日本、伊朗、葡萄牙、智利和韩国等二十个国家中出现,并 对全球雜猴桃产业造成了重大经济损失。目前,该病在我国的陕西、四川、湖南、贵州、江苏、 浙江、广西和安徽等10个省份均已发生,仅2013年,感病面积已达到1828公顷,累计经济 损失3. 23亿元。雜猴桃溃瘍病菌主要借助风雨,或在修剪、绑枝等操作时借助操作工具,从植株的 气孔、水孔、皮孔、伤口(虫伤、冻伤、刀伤)等处侵入,扩延至整个枝蔓及果园发病。在我 国,该病一般在2月下旬至3月上旬开始发病,主干和枝条感病后龟裂,产生乳白色粘质菌 脈;在3月中下旬至4月下旬,与植物伤流混合后呈黄褐色或诱红色,初皮部局部溃瘍腐烂。 叶片上一般在4月份开始出现症状,在新生叶片上呈现不规则形或多角形、褐色斑点,后发 展成病斑周围有3-5mm的黄色晕圈,叶片焦枯、卷曲。藤蔓上感病后,部分变成深绿色、水溃 状,常形成l-3mm长的纵向裂缝。4月下旬到5月中旬,溃瘍病菌开始侵染花蕾,花蕾感病 后不能张开,变褐枯死后脱落。6月份至8月份,溫度升高时,病原菌进入休眠期。9-11月, 部分地区叶片和枝条上可能再次出现感病症状。12月至来年2月,病原菌主要在植株的皮 孔、气孔及果柄处定植,也可随病残体在±壤中定植,侵染速度减弱;来年2月继续侵染,由 此形成周年循环,严重时导致树体死亡(具体感病症状见图1)。 雜猴桃溃瘍病的病原菌是下香假单胞杆菌雜猴桃致病变种(简称Psa),是一种细 菌性病害。由于雜猴桃细菌性溃瘍病已被列入全国森林检疫对象名单,因此在最短的时间 内快速检测外来或本地苗木上是否带有病原菌是防止该病扩散的有效手段,也是目前的重 点研究方向。 雜猴桃溃瘍病的诊断技术经历了从表面症状观察一菌落形态观察一显微镜检查 一PCR快速检测4个阶段。PCR技术是20世纪80年代中期建立的一项体外迅速、大量扩 增目的基因的技术,已广泛地应用于分子生物学、医学和农学等学科,用于基因的克隆遗传 分析和疾病诊断等。由于PCR能够特异扩增某一DNA片段,因此,在病原微生物的检测上, 比传统方法有优势,如PCR技术检测生物体时不需要培养,具有极高的灵敏度和快速等。近 10多年来,PCR技术在植物病害检测中得到了广泛应用,也有不少学者对雜猴桃溃瘍病菌 (Psa)分子检测技术进行了研究,如2010年,Rees-George等基于rDNA的16-23S内转录间 隔区(ITS序列)设计了 1对雜猴桃溃瘍病菌的特异性鉴定引物(PsaFl、PsaR2),并将引物 在与PSA病原菌亲缘关系较近的6个属17个种共计56个菌株进行了特异性扩增,进一步 验证了 引物的可靠性(Plantpathology, 2010, 59:453-464)。2011 年,Marcelletti等运 用通用引物对Psa及其他P.syringae菌株的7个持家基因gy;rB、巧oB、巧〇0、acnB、fruK、 gltA及pgi序列进行了MLST分析,认为Psa菌株与P.syringaepv.theae亲缘关系最近 (PLoS0肥,2011,6 :1-17)。 雜猴桃溃瘍病感病样本的快速鉴定,可W使我们尽快准确地确定样本中是否含有 病原菌,防止病原菌的大规模传播,同时促进了该病原菌WDNA为基础的检测方法的发展。 但目前,尚未有雜猴桃溃瘍病感病样本的快速鉴定方法的相关专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是弥补现有技术的不足,提供一种雜猴桃溃瘍病感病样本的快速鉴 定方法;本专利技术能在3天时间内实现雜猴桃溃瘍病感病样本的快速鉴定。 本专利技术的目的是运样实现的:首先,利用组织匀浆技术释放分离样本中的细菌,通 过培养使其增殖,并运用高溫裂解的方法获得样本的DNA;随后,基于特异性引物扩增是否 出现条带,初步确定病原菌中是否含有Psa病原菌;最后,对意思病原菌的持家基因gltA进 行测序,通过与NCBIBlast中进行序列比对确定该病原菌是否为Psa。 具体地说,本方法包括下列步骤: ①病原菌的分离 将疑似患有细菌性溃瘍病的雜猴桃感病样品表面用无菌水冲洗干净,然后用打孔 器从感病部位、健康部位和病健交界处分别切取组织,经酒精消毒和无菌水冲洗,再用无菌 滤纸吸干表面水分,得到组织切片;将组织切片置于400yL的lOmmol/LM拆〇4溶液中进行 匀浆,即得匀浆液; ②病原菌的培养 取IOOyL的匀浆液涂布在固体邸(金氏B)培养基上,将平板置于27-28°C培养 2d;[001引③病原菌的菌落PCR检测 [001引A、模板DNA的制备 吸取40yL无菌水置于布满菌落的平板上,用无菌接种环刮擦菌苔,尽可能使平 板上的菌落悬浮在无菌水中,形成菌悬液,再将菌悬液置于98°C裂解IOmin之后满旋,闪 离,吸取2yL上清液用于DNA模板;[001引B、引物序列正向引物为PsaFl:5' -TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3'(SEQNO. 1); 反向引物为PsaR2 :5, -CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3'(沈QNO. 2); 预期扩增产物长度为28化P;[002引 C、菌落PCR扩增体系反应体系为IOyL其中IOXPCRbuffer1yLlOmmol/LdNTP0. 2yL100y mol/L正向引物PsaFl0.IyL,100ymol/L反向引物PsaR20.IyL,5U/yLTaq酶 0.IyL, DMSO0. 2JiL,菌落模板2JiL,无菌去离子水6. 3JiL;D、PCR扩增反应程序95°C预变性5min,94°C变性15S,58°C退火30S,72°C延伸30S,30个循环,72°C延伸 5min,-20°C保存; E、取PCR扩增产物5化,用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果,在280bp处出现单 一扩增条带的样本初步鉴定含有雜猴桃溃瘍病的病原菌; ④病原菌的分子鉴定[002引 a、模板DNA的制备 对于有特异性条带的样本,吸取步骤③中的2yL上清液用于DNA模板; b、引物序列 正向扩增引物为gltAFP:5' -GCCTCBTGCGAGTCGAAGATCACC-3'(沈QNO. 3); 反向扩增引物为gltARP:5, -CTTGTAVGGRCYGGAGAGCATTTC-3'(沈QNO. 4); 正向测序引物为gltAFS:5, -CCTGRTCGCCAAGATGCCGAC-3,(沈QNO. 5); 反向测序引物为gltARS:5' -CGAAGATCACGGTGAACATGCTGG-3'(SEQNO. 6); 预期扩增产物长度本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法,其特征在于包括下列步骤:①病原菌的分离将疑似患有细菌性溃疡病的猕猴桃感病样品表面用无菌水冲洗干净,然后用打孔器从感病部位、健康部位和病健交界处分别切取组织,经酒精消毒和无菌水冲洗,再用无菌滤纸吸干表面水分,得到组织切片;将组织切片置于400μL的10mmol/L MgSO4溶液中进行匀浆,即得匀浆液;②病原菌的培养取100μL的匀浆液涂布在固体KB培养基上,将平板置于27‑28℃培养2d;③病原菌的菌落PCR检测A、模板DNA的制备吸取40μL无菌水置于布满菌落的平板上,用无菌接种环刮擦菌苔,尽可能使平板上的菌落悬浮在无菌水中,形成菌悬液,再将菌悬液置于98℃裂解10min之后涡旋,闪离,吸取2μL上清液用于DNA模板;B、引物序列正向引物为PsaF1:5’‑TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT‑3’;反向引物为PsaR2:5’‑CACGCACCCTTCAATCAGGATG‑3’;预期扩增产物长度为280bp;C、菌落PCR扩增体系反应体系为10μL,其中10×PCR buffer 1μL,10mmol/L dNTP 0.2μL,100μmol/L正向引物PsaF1 0.1μL,100μmol/L反向引物PsaR2 0.1μL,5U/μL Taq酶0.1μL,DMSO 0.2μL,菌落模板2μL,无菌去离子水6.3μL;D、PCR扩增反应程序95℃预变性5min,94℃变性15S,58℃退火30S,72℃ 延伸30S,30个循环,72℃延伸5min,‑20℃保存;E、取PCR扩增产物5μL,用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果,在280bp处出现单一扩增条带的样本初步鉴定含有猕猴桃溃疡病的病原菌;④病原菌的分子鉴定a、模板DNA的制备对于有特异性条带的样本,吸取步骤③中的2μL上清液用于DNA模板;b、引物序列正向扩增引物为gltAFP:5’‑GCCTCBTGCGAGTCGAAGATCACC‑3’;反向扩增引物为gltARP:5’‑CTTGTAVGGRCYGGAGAGCATTTC‑3’;正向测序引物为gltAFS:5’‑CCTGRTCGCCAAGATGCCGAC‑3’;反向测序引物为gltARS:5’‑CGAAGATCACGGTGAACATGCTGG‑3’;    预期扩增产物长度为1000bp;c、菌落PCR扩增体系反应体系为40μL,其中10×PCR buffer 4μL,10mmol/L dNTP 0.8μL,100μmol/L正向扩增引物gltAFP 0.2μL,100μmol/L反向扩增引物gltARP 0.2μL,5U/μL Taq酶0.25μL,DMSO 0.8μL,菌落模板2μL,无菌去离子水31.75μL;d、PCR扩增反应程序95℃预变性5min;94℃变性15S,62℃退火30S,72℃ 延伸30S,30个循环;72℃延伸5min,‑20℃保存;e、取PCR扩增产物40μL,送样测序,正向测序引物为gltAFS,反向测序引物为gltARS;测序结果与NCBI BLAST进行序列比对,如比对结果与Psa菌株相似度达到99%以上,确定该样本中含有猕猴桃溃疡病的病原菌。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:李黎黄宏文钟彩虹刘义飞陈美艳潘慧
申请(专利权)人:中国科学院武汉植物园
类型:发明
国别省市:湖北;42

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