一种改良简化的植物染色体荧光原位杂交方法技术

本发明专利技术提供了一种改良简化的植物染色体荧光原位杂交方法。由于该方法不包括杂交前对标本玻片的长时间脱水过程和杂交后对标本制片的多次漂洗流程，因此是一种对生物细胞样品中的核内染色体进行快速原位杂交的技术。所述方法主要涉及：1）通过变温催芽、8-羟基喹啉预处理和卡诺固定液固定植物根尖分生区细胞分裂旺盛的组织，获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本；2)不同标记荧光探针混合后，一次变性完并低温保存，可实现长期多次使用；3)标本制片采用NaOH醇溶液变性；4）杂交反应过程中，通过简化多步脱水、漂洗等操作步骤，从而极大地精简了整个繁琐的杂交流程。尤其是，所述方法特别适用于快速大规模检测和分析植物远缘及近缘杂交种中的外源染色体和染色体片段，同时很好地保持了标本染色体形态和结构的真实性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种改良的基于碱变性的荧光原位杂交方法，由于该方法不包括杂交前对标本玻片的长时间脱水过程和杂交后对标本制片的多次漂洗流程，因此是一种对生物细胞样品中的核内染色体进行快速原位杂交的技术，属于分子细胞遗传学及染色体工程

技术介绍
焚光原位杂交(Fluorescencein situ hybridizat1n, FISH)是 20 世纪 80 年代在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种重要的非放射性分子细胞遗传学技术，是以非放射性荧光标记取代放射性同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。FISH技术是根据核酸碱基互补配对原理，用半抗原标记DNA (或者R NA)探针，与经过变性的单链核酸序列互补配对，通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测，或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合，最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况。从其诞生发展至今，FISH技术已完全克服了同位素杂交的不足，诸如探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高以及同位素操作较繁琐等，逐渐形成了安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示细胞分裂中期分裂相，还能显示细胞分裂间期核。截至目前，FISH已被广泛应用于染色体的识别、DNA序列或基因的定位、核型分析、基因组进化研究、物理图谱的构建、转基因生物的鉴定等； 在植物远缘及近缘杂交种的遗传学分析与育种研究中，FISH技术在外源染色体的识另IJ、畸变染色体的检测与分析方面发挥着重要的作用，为染色体或基因组的研究提供了强大的工具。无论是创建用于染色体细胞作图的遗传突变体，还是创制育种上的新种质资源，开展大量的基于FISH技术的遗传材料筛选是必不可少的。这就要求具有一套周期短、简单、易于操作、高效的FISH技术。然而纵观当前广泛使用的经典荧光原位杂交方法，虽然经过了不断的改进与完善，但关键的杂交程序操作复杂，步骤繁琐，极大地降低了实验效率。此外，有些经典杂交程序操作过程作中还需要使用具有毒性的变性试剂，不仅对实验操作人员的身体健康构成威胁，而且对生态环境造成危害；针对现有FISH技术操作步骤繁琐与周期长，以及部分方法存在的安全隐患等问题，本专利技术在利用成本低廉、易于配制、无毒性、重复利用率高的NaOH醇溶液作为变性剂的基础上，通过简化脱水和漂洗等繁杂步骤，不仅极大地缩短了试验流程，而且避免了经典杂交方法中由于热变性和冗长漂洗等引起的染色体失真问题，保持了染色体的最佳形态，更有利于对外源染色体的鉴定与结构组成分析以及染色体间相互重组的观察。故本专利技术既体现了简单高效、生态环保、经济实用的特征和优势，特别适用于快速大规模检测和分析植物远缘或近缘杂交种中的外源染色体和染色体片段，同时又很好地保持了标本染色体形态和结构的真实性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简便、高效、实用，能够规模化检测分析或筛选植物远缘及近缘杂交种中外源染色体和染色体片段的荧光原位杂交方法，其包括以下步骤: 1)根尖培养。将植物种子置于底层铺有湿润滤纸的培养皿中，在23°c黑暗培养箱中催芽，待种子露白后，连同培养皿一起转移至4°C冰箱，放置1-3天。然后继续转移到23°C黑暗培养箱中继续催芽，至根系长约2-3cm ； 2)标本制作。a.取材:剪取1)中发芽种子的?lcm根尖，迅速投放到盛有IX10 6Μ 8-羟基喹啉的小瓶中(提前置于冰水混合物中)，在0°C的冰箱中放置14-20h。b.固定:将根系转移到盛有卡诺固定液=3:1)的离心管中，在30°C下固定2?3天(或在室温下固定3-5天)。c.染色:用醋酸洋红染色根系15-20分钟。d.制片:用解剖针或解剖刀片切取带有分生区的根尖组织，放在载玻片上，滴加一滴45%醋酸溶液，加盖盖玻片，然后用拇指轻压或用竹签轻敲使细胞分散良好。e.镜检:装片于显微镜，观察细胞内染色体分布情况，并将分散良好的玻片标本保存于-70°C以下冰柜； 3)探针标记。利用CTAB法或植物基因组提取试剂盒提取植物基因组DNA，利用随机引物法标记基因组的荧光探针，以及利用PCR法标记DNA片段荧光探针(注意双标记要设计两种不同颜色的探针)。将标记的荧光探针按适当比例与杂交液按一定体积比一起混合，在沸水浴中变性8-10分钟，立即置于_20°C的酒精缸中20分钟以上，后将变性探针杂交液保存于-4。。； 4)荧光原位杂交。a.脱色:从-70°C冰柜中取出标本玻片，用刀片撬除盖玻片，置于42-45°C的45%醋酸中脱色2-3分钟(若制片过程中未对根尖染色，此步骤则省略)，用洗耳球吹干或空气晾干。b.变性:将风干的标本制片浸于0.15当量NaOH醇溶液(70%乙醇)中，变性5分钟。c.脱水:将变性后玻片依次通过70%、70%、99%乙醇中分别脱水5分钟，然后立即吹干。d.杂交:向吹干标本制片目标区域滴加10-15PL变性探针杂交液，加盖盖玻片。将标本玻片放入保湿的杂交盒中，然后置于30°C培养箱杂交?6h。e.漂洗:将杂交后的标本制片移掉盖玻片后浸入2 X SSC溶液中，漂洗5分钟，拿出玻片迅速用蒸馏水冲洗2-3下，立即吹干。g.抗体反应:向吹干标本制片滴加ιο-?5μ?抗体(若为双标记探针检测，则抗体为各探针对应抗体的混合抗体)，加盖盖玻片，放入保湿杂交盒中，置于30 °C培养箱反应lh(若探针为单一的荧光素标记，此步骤则省略)。f.复染:取出抗体反应后的标本玻片并移掉盖玻片，用蒸馏水冲洗2-3下，立即吹干，滴加10-15PL DAPI染色液，加盖盖玻片，室温染色5分钟以上； 5)镜检。将原位杂交后的标本玻片装于荧光显微镜上，观察并分析杂交信号。选取染色体分布均匀、荧光杂交信号清晰的细胞视野照相，并保存； 上述的标记探针与原位杂交液的混合比例取决于最低的噪信比(即在获得最低的背景信号下，但能够得到足够强的荧光原位杂交信号以保证镜检和照相)，可以根据不同来源的标记探针与具体不同的实验目的选配体积比。整个荧光原位杂交操作步骤，除非特别说明，均在室温下进行。有益效果 本专利技术的技术优势及有益效果在于: 1)根系固定前，采用变温催芽处理，并通过低浓度(1X10 6 Μ)8-羟基喹啉预处理根系，更有利于获得细胞分裂中期染色体分裂相； 2)变性前，标本制片在45%醋酸中脱色后，空气晾干或吹干后可以直接进入变性过程，无需在酒精中进行长时间的脱水过程，缩减了反应步骤，缩短了实验时间； 3)利用0.15当量NaOH醇溶液对染色体进行变性，替代了经典的加热变性或用有毒致畸变性剂的变性，省去了加热变性所需的设备(如水浴锅或电热板等)或储存有毒变性剂的特殊器皿，而且NaOH醇溶液可连续多次使用，变性成本低，方法操作简单；同时变性效果好，且变性原料安全、低碳、环保，重复利用率高； 4)标记探针与杂交液混合完成变性后，可长期低温保存，荧光原位杂交实验过程中可直接使用，从而省去了每次原位杂交实验中探针杂交液现用现配的繁琐操作，简化了实验步骤； 5)整个杂交反应过程在相对较低的温度(30°C)下进行，故减少了非特异杂交反应，从而降低了噪音或背景信号的干扰。另外，此反应条件下无需使用封阻DNA，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良简化的植物染色体荧光原位杂交方法，其特征在于：在标本制片过程中，（1）根尖的培养：种子采用23℃先催芽，待露白转至4℃放置1‑3天，后又放回23℃继续发芽至根系长约2‑3cm；（2）根尖预处理：将适宜长度的根尖收集于1×10‑6 M 8‑羟基喹啉中，于0℃冰水混合物下处理14‑20h；（3）固定：用卡诺固定液（V冰醋酸 : V无水乙醇=1 : 3）于30℃下固定2～3天（或室温下固定3‑5天）；（4）染色并制片：用醋酸洋红染色根尖15‑20分钟后，切下根尖分生组织，滴加45%醋酸后压片并烤片。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李建建，郭海林，张兵，刘建秀，汪毅，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32