长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用。该长链非编码RNA LOC401317可以用于制备鼻咽癌患者的预后制剂，特别是制备出原位杂交检测法预测鼻咽癌患者预后的试剂盒。通过研究证实LOC401317在鼻咽癌组织中表达下调，低表达LOC401317的鼻咽癌患者比高表达LOC401317的鼻咽癌患者预后差，因此，将LOC401317的表达用于鼻咽癌患者的预后预测，可以为鼻咽癌患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用方法。 
技术介绍
鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，其中抑癌基因的失活与癌基因的激活发挥了关键的作用。 TP53基因(编码p53蛋白)自1979年被克隆以来，一直是肿瘤分子生物学研究领域最引人注目的重要抑瘤基因之一。大量的证据表明，TP53基因通过调控一系列信号转导通路广泛参与了多种恶性肿瘤的发生发展。在细胞受到各种致癌因素的刺激时，p53蛋白激活并通过转录调控下游关键靶基因的表达，阻滞细胞周期、诱导细胞分化、启动细胞衰老及凋亡、参与DNA损伤修复维持基因组的稳定、调节能量代谢和抑制肿瘤血管生成，从而阻止肿瘤的发生发展。已有的研究发现，TP53基因是包括鼻咽癌在内的多种恶性肿瘤中最常见的突变基因之一，33％～76％的患者存在TP53基因异常。因此，恢复鼻咽癌中TP53基因功能或逆转其下游信号通路，对鼻咽癌的治疗具有重要的意义。 长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过200nt、缺少特异完整的开放阅读框、无或很少有蛋白编码功能的RNAs分子。最近的研究表明，lncRNAs通过在表观遗传、转录和转录后水平广泛调节基因的表达，它们参与了生物体生长、发育、衰老及死亡等重要生命活动的调控。越来越多的研究表明lncRNAs的异常表达或功能缺失与肿瘤的发生发展密切相关。一些lncRNAs分子在肿瘤的诊断和治疗方面具有重要的意义，且可以作为肿瘤预后判断新的分子标记。目前，已经克隆的人类lncRNAs基因已超过4万多个，但绝大部分lncRNA的功能未知。 为了寻找鼻咽癌中TP53基因调控的下游lncRNAs及其在鼻咽癌中的应用价值，我们在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因，收集不同时间点的细胞用新一代lncRNAs芯片检测了已知 lncRNA的表达水平。芯片检测的结果显示，lncRNA LOC401317的表达差异最显著，其表达明显上调，提示LOC401317可能具有抑瘤基因的作用。 我们构建了表达LOC401317的真核表达载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培养系统和裸鼠移殖瘤体内模型中均证实lncRNA LOC401317可明显抑制鼻咽癌细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的生长，因此LOC401317是一个新的抑瘤性lncRNA。将LOC401317真核表达载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒，可保护LOC401317载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。 进一步地，我们检测了LOC401317在临床离体肿瘤样本中的表达水平，并分析了LOC401317表达水平与临床病例资料的相关性。我们从鼻咽癌及相对应的正常对照组织中抽提RNA后通过逆转录，实时定量PCR，检测了LOC401317的表达情况，结果显示LOC401317在鼻咽癌组织中表达下调。我们随后又利用原位杂交的方法，进一步在存档石蜡样本验证了LOC401317在鼻咽癌中表达显著下调，因此针对LOC401317的检测制剂可用于鼻咽癌的辅助诊断，结合临床回访资料进行生存曲线分析发现LOC401317表达低的患者其生存时间短于该lncRNA表达高的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后判断。 
技术实现思路
本专利技术的目的是提供长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用方法，利用长链非编码RNA LOC401317序列可以制备用于鼻咽癌辅助诊断或者预后预测的制剂。 lncRNAsLOC401317的应用方法，用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂，该长链非编码RNA LOC401317的序列见SEQ NO:1。 所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂为原位杂交检测试剂。 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测LOC401317表达的寡核苷酸探针，序列如下： LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’ LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’。 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。 试剂盒中含有上述用于原位杂交检测LOC401317表达的寡核苷酸探针： LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’ LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’； 阳性对照探针(检测看家基因GAPDH)： GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH探针2：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂、DAB染色试剂； 其它常规生物化学试剂，包括20x柠檬酸钠缓冲溶液(saline sodium citrate,SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去离子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，变性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’s solution)，磷酸缓冲液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，醋酸酐，阻断试剂(Blocking reagent agent)，TNB缓冲液(即：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.5％阻断试剂)，TNT缓冲液(即：pH7.5的0.1M Tris-Cl+0.15M NaCl+0.05％Tween 20)。 我们通过原位杂交在鼻咽癌和正常鼻咽上皮存档石蜡组织标本中发现LOC401317在鼻咽癌中表达显著下调，且LOC401317的表达与预后密切相关，LOC401317表达低的患者更快地死亡，提示LOC401317可作为鼻咽癌预后预测的分子标志。本专利技术为鼻咽癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。 附图说明图1为TP53基因可诱导lncRNA LOC401317表达情况； A：在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体0、12、24和48小时后用实时荧光定量PCR检测TP53基因的表本文档来自技高网...

【技术保护点】
长链非编码RNA LOC401317的应用方法，其特征在于，用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂，该长链非编码RNA LOC401317的序列见SEQ NO:1。

【技术特征摘要】
1.长链非编码RNA LOC401317的应用方法，其特征在于，用于制备鼻咽癌辅助诊断或
者疗效预测的制剂，该长链非编码RNA LOC401317的序列见SEQ NO:1。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测
的制剂为原位杂交检测试剂。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，
所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测LOC401317表达的寡核苷酸探针，
序列如下：
LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’
LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’。
4.根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于，
所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。
5.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于，
试剂盒中含有用于原位杂交检测LOC401317表达的寡核苷酸探针：
LOC401317探针1：5’-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3’
LOC401317探针2：5’-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3’；
试剂盒中还含有阳性对照探针，
GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'
GAPDH探针2：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。
6.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于，
试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂、
DAB染色试剂；
其它常规生物化学试剂，包括20x SSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚
脱氧腺苷酸，变性剪切的蛙精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardt...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂源，曾朝阳，熊炜，龚朝建，李小玲，张文玲，李夏雨，曾勇，周鸣，马健，彭淑平，向波，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43