脱乙酰几丁质/海藻酸钠干细胞微囊及其制备和培养方法技术

本发明专利技术提供了一种脱乙酰几丁质/海藻酸钠干细胞微囊及其制备和培养方法，制备方法包括：将海藻酸钠于水中分散后再加入待培养的干细胞，制成海藻酸钠和细胞的混合悬液；将脱乙酰几丁质用醋酸盐缓冲液分散，制成脱乙酰几丁质溶液；将混合悬液加入至所述脱乙酰几丁质溶液中进行凝聚。本发明专利技术制备微囊相比通常的聚赖氨酸/海藻酸钠细胞培养微囊，其包膜结构采用脱乙酰几丁质和海藻酸钠形成，两者不仅阴阳离子电性结合，还进一步利用脱乙酰几丁质的强吸附性，提升结合形成的包膜的强度，可以防止其在培养过程中被降解。具有更良好的溶胀、缩胀等稳定性能，能形成较好的细胞生长环境，提升细胞培养扩增的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微囊化细胞培养
，具体涉及一种脱乙酰几丁质/海藻酸钠干 细胞微囊及其制备和培养方法。
技术介绍
微胶囊本身是一种把分散的固体物质、液滴或气体包封在一层致密膜中形成的包 覆体复合结构，用于包覆的致密膜通常是由天然或合成高分子材料制成。由于其具有上述 包覆的微囊按结构，其功能应用中可以将酶、辅酶、蛋白质等生物大分子或动植物细胞包围 在珠状的微囊里，而小分子的物质、培养基的营养物质可以自由出入半透膜，达到便于催化 或培养的目的，所以微囊经常被用于细胞三维培养，即微囊化细胞培养。 微囊化细胞培养中采用微囊的亲水性半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不 会溢出，同时小分子物质及营养物质可以自由出入半透膜；囊内用作为细胞的培养环境，与 液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故相比其他的微珠载体、支架等常规的三维培养方式 细胞生长好、密度高。 目前微囊化细胞培养中，包膜材料最通常采用的是海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊； 其中，海藻酸钠是属于从海洋的褐藻中提取的直链阴离子多糖，具有良好的生物相容性，并 且其分子结构孔隙和稳定性都比较好，所以其在具有力学骨架长期稳定优势的条件下，非 常适合于被用作微囊的半透膜骨架，既具有良好的生物相容性，又能保持良好的通透性。聚 赖氨酸是人工合成的阳离子聚合物，在水相中与阴离子海藻酸钠混合时，两者的阴、阳离子 发生快速反应交联成厚约20~100μm半透膜的微胶囊。 但是，上述海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊在用作为药物缓释、靶向释放控制、或者是 一些活性成分保护中，基本上能较好地满足使用的要求。但是在作为干细胞培养载体使用 时，海藻酸钠与聚赖氨酸之间的阴、阳离子化学结合，易被培养液成分破坏而导致包膜破 碎，并且还容易引起微囊周纤维化反应。因此微囊内不能形成较好的细胞生长环境，细胞培 养扩增效率较低、形成的凝胶珠硬度较高，不利于干细胞的培养。
技术实现思路
本专利技术实施的目的在于克服现有海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊的缺陷，提供一种脱 乙酰几丁质/海藻酸钠干细胞微囊及其制备和培养方法。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下： -种脱乙酰几丁质/海藻酸钠干细胞微囊的制备方法，包括如下步骤： 获取脱乙酰几丁质和海藻酸钠； 将所述海藻酸钠于水中分散后，再加入待培养的干细胞，制成海藻酸钠和细胞的 混合悬液； 将所述脱乙酰几丁质用醋酸盐缓冲液分散，制成脱乙酰几丁质溶液； 将所述混合悬液加入至所述脱乙酰几丁质溶液中进行凝聚。本专利技术进一步还提出采用上述方法直接制备得到的脱乙酰几丁质/海藻酸钠干 细胞微囊。本专利技术相比海藻酸钠/聚赖氨酸的微囊包膜，其包膜结构为脱乙酰几丁质和海藻 酸钠，两者不仅阴阳离子电性结合，并进一步利用脱乙酰几丁质的强吸附性，提升结合形成 的包膜的强度，可以防止其在培养过程中被降解。并且这两者之间共同纤维结合形成半透 膜骨架，既具有良好的生物相容性，又能保持良好的通透性，还能够保持一定的融合性，不 会形成微囊周纤维化反应；形成的膜结构具有良好的溶胀、缩胀等性能，用于细胞培养时其 透性和稳定性上更好一些，能形成较好的细胞生长环境，提升细胞培养扩增的效率。同时，还提出用上述微囊进行细胞培养的方法，方法过程包括：将羧甲基纤维素/ 海藻酸钠干细胞微囊于培养容器中进行大量培养。本专利技术的上述培养方法，采用的细胞微囊能具有更良好的溶胀、缩胀等稳定性能， 用于细胞培养时其透性和缓冲性上更好一些，能形成较好的细胞生长环境，提升细胞培养 扩增的效率。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于 限定本专利技术。本专利技术实例提出一种脱乙酰几丁质/海藻酸钠干细胞微囊的制备方法，步骤包 括： S10,获取脱乙酰几丁质和海藻酸钠； S20,将海藻酸钠于水中分散后，再加入待培养的干细胞，制成海藻酸钠和细胞的 混合悬液； S30,将脱乙酰几丁质用醋酸盐缓冲液分散，制成脱乙酰几丁质溶液； S40,将海藻酸钠和细胞的混合悬液加入至脱乙酰几丁质溶液中，待凝聚后获取微 囊。本专利技术相比海藻酸钠/聚赖氨酸的微囊包膜，用脱乙酰几丁质代替聚赖氨酸成 膜，本身几丁质又称壳多糖，为N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖；将几丁 质进行脱乙酰基后形成的脱乙酰几丁质，是具有大量正电荷基团的动物纤维素。其结构与 植物纤维素非常相似，都是六碳糖的多聚体，分子量都在100万以上；由于它的分子结构中 带有不饱和的阳离子基团，因而对带负电荷的同类物质具有强大的吸附作用；而且，分子量 越尚吸附能力越强。脱乙酰几丁质与海藻酸钠上有较多相似的地方，且本身海藻酸钠是属于从海洋的 褐藻中提取的直链阴离子多糖，能够与具有强大的吸附作用的脱乙酰几丁质形成比较稳定 的结合，形成的包膜比海藻酸钠与聚赖氨酸之间的阴、阳离子化学结合要强得多。并且两者 之间共同纤维结合形成半透膜骨架，既具有良好的生物相容性，又能保持良好的通透性，还 能够保持一定的融合性，不会形成微囊周纤维化反应。基于本案中优选的实施方式中，上述步骤S10中获取的物料中，脱乙酰几丁质采 用脱乙酰度90%以上的脱乙酰几丁质进行，除了在可溶性上比较好之外，更主要地是不饱 和阳性基团密度更大一些，这样相比吸附性更强一些。 在制备的过程中，采用将海藻酸钠溶解，然后将其加入至脱乙酰几丁质溶液中，表 面接触的部分会快速的吸附结合、形成凝胶化最终成为薄膜，内部的细胞和海藻酸溶液以 悬液的形态被包覆在膜内。当然，按照微囊形成的制备方式，步骤S40中将海藻酸钠和细胞 的混合悬液加入至脱乙酰几丁质溶液的方式，采用滴加或者是针头注射的方式进行。同时，进一步为了保证形成微囊之后，细胞能具有相对比较适合的生长和扩增的 能力，步骤S20混合悬液的配置中优选细胞与海藻酸钠的混合悬液中干细胞的浓度控制 0. 5~2X107个/mL。微囊内包覆的细胞密度过低，在培养的过程中比较难以快速生长增 殖；而如果过高，本身微囊内的空间有限，细胞之间的空间和养料竞争加剧，位置处于竞争 性劣势的细胞一旦出现凋亡，也会诱发其他正常细胞的凋亡，所以尽量使微囊内的细胞处 于比较适合的浓度范围，空间和养料获取都处于比较均一的程度，更利于细胞的培养。 进一步出于形成包膜的品质，如果步骤S40中采用针头注射的方式将干细胞与海 藻酸钠的混合悬液加入至脱乙酰几丁质溶液中，那么注射的速率控制2~8mL/min，因为 注射的快慢都会影响表面包膜形成的品质和稳定性。并且，出于上述两者在电性吸附下凝 胶化形成微囊品质的立意，干细胞与海藻酸钠的混合悬液中，海藻酸钠的质量体积浓度为 0. 5~2%;对应步骤S30配置脱乙酰几丁质的醋酸盐缓冲液中，脱乙酰几丁质浓度为0. 5~ 2 % (w/v)。注射的过程中，尽量保证针头位置始终与装脱乙酰当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱乙酰几丁质/海藻酸钠干细胞微囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：获取脱乙酰几丁质和海藻酸钠；将所述海藻酸钠于水中分散后，再加入待培养的干细胞，制成海藻酸钠和细胞的混合悬液；将所述脱乙酰几丁质用醋酸盐缓冲液分散，制成脱乙酰几丁质溶液；将所述混合悬液加入至所述脱乙酰几丁质溶液中进行凝聚。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44