本发明专利技术公开了一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液及分离方法。所述分离消化液为含表面活性剂的酶溶液，所述消化液为含表面活性剂的I型胶原酶溶液。所述分离方法包括用消化液振荡消化跟腱组织，所述消化液为含表面活性剂的酶溶液。本发明专利技术在消化硬度较大的组织块时，使用含有表面活性剂的消化液，降低振荡消化过程中细胞受到的剪切力，保证良好的细胞状态；振荡消化可以有效缩短消化时间，仅消化30分钟就可以得到小的跟腱组织块，消化效率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及干细胞的分离培养领域，尤其设及一种跟腫来源肌腫干细胞原代分离 消化液及分离方法。
技术介绍
肌腫是连接骨骼与肌肉的强初的纤维结缔组织。肌腫炎通常是指由于肌肉纤维过 度使用，反复强烈牵拉而引起肌腫胶原纤维退行性病变，除了累及肌腫本身，还可W累及腫 銷。W往诊断常用肌腫炎来统称，但事实上肌腫炎并非单一的炎症，大多数情况下，常合并 为受累肌腫胶原组织变性，因此现在通称为肌腫病。 肌腫病在高运动量的人群中常见，W局部疼痛、肿胀、功能障碍为临床特征，常见 发病部位为肩袖、岗上肌、骸腫及跟腫。目前肌腫病的发病机制尚未完全研究清楚，国内外 学者一致认为肌腫内细胞异常增生、细胞外基质的变化是肌腫病发病的基础。2007年美 国学者从人和兔的肌腫中分离出一种具有自我更新能力的细胞，将其命名为肌腫干细胞 (TDSCs)或肌腫祖细胞。2010年香港学者从鼠肌腫中也分离出肌腫干细胞。有学者提出肌 腫干细胞的异常分化可能是肌腫病的发病基础。肌腫干细胞具有多向分化潜能和自我更新 能力，可W分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞。 股骨头坏死是骨科常见病、多发病，病程长且致残率高。如何有效地治疗成人股骨 头坏死，防止疾病的进一步发展，保护股骨头，延缓髓关节置换的手术时间，是其治疗的重 点。虽然目前保髓手术的方法很多，如髓忍减压、带血管蒂的脾骨移植、移植骨髓间充质干 细胞、表面置换等，均取得一定疗效，但均具有一定的缺陷，不能完全达到人们的期望。肌腫 干细胞具有明确的干细胞特性，适合修复股骨头坏死的病理过程，因此有望成为治疗股骨 头坏死新的种子细胞。 原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞，有人把培养的第1代与传10代W内 的细胞统称为原代细胞。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究， 还可应用于当今热口的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物等的研 究。原代细胞在生物医药领域有不可替代性作用，市场前景广阔。在块状组织的原代分离 中，现有技术主要是W机械研磨或酶消化法得到更小的组织块，再进行组织块培养，筛选出 能生长出单一种类细胞集合的"细胞岛"，然后通过扩大培养、鉴定得到纯种细胞。运些方法 主要针对硬度较小的组织，且需要处理的时间大多较长。运些方法在处理像跟腫运样有一 定硬度的组织上效果尚差。如机械研磨法的研磨力度过大会导致目的细胞受损严重，而力 度太小需要较长时间的研磨，最后一样得不到理想的细胞状态，分离率低。酶消化法的消化 条件比较溫和，但是消化时间很长。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种跟腫来源肌腫干细胞原代分离消化 液及分离方法。 一种跟腫来源肌腫干细胞原代分离消化液，所述消化液为含表面活性剂的酶溶 液。 优选地，所述消化液为含表面活性剂的I型胶原酶溶液。 更优选地，所述消化液中I型胶原酶的浓度为l-5mg/mL。 更进一步优选地，所述消化液中I型胶原酶的浓度为3mg/mL。 优选地，所述表面活性剂为非离子表面活性剂。 更优选地，所述非离子表面活性剂为泊洛沙姆。 优选地，所述表面活性剂的含量为10-30mg/mL。 一种跟腫来源肌腫干细胞原代分离方法，用上述消化液振荡消化跟腫组织，所述 消化液为含表面活性剂的酶溶液。 优选地，所述跟腫来源肌腫干细胞的原代分离方法，包括W下步骤： S1、将跟腫组织碎块与上述消化液混合，100-17虹pm消化20-40min; S2、过滤获得单细胞悬液，250-500g离屯、5min，弃上清，用完全培养基重悬细胞沉 淀，转入培养皿中，于37°C，5%C〇2环境下培养，每3d补液一次，培养至细胞贴壁，贴壁细胞 即为跟腫来源肌腫干细胞原代细胞。 优选地，消化液中泊洛沙姆浓度为20mg/mUI型胶原酶浓度为3mg/mL;在37°C、 150巧m条件下消化30min。 优选地，所述完全培养基为含10%FBS、100U/mL青霉素、lOOmg/血链霉素的 培养基。 优选地，在消化前需要预处理跟腫组织，即将跟腫组织用PBS清洗，剪切成约 1mmX1mmX1mm大小的碎块。 优选地，步骤S1中500mg跟腫组织碎块与6血消化液混合，步骤S2中用10血完 全培养基重悬细胞沉淀，转入10cm培养皿中，每3d补液5mL。 优选地，所述跟腫组织为人跟腫组织。 与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术在消化硬度较大的组织块时， 使用含有表面活性剂的酶溶液作为消化液，表面活性剂可W降低振荡消化过程中细胞受到 的剪切力，从而减少细胞所受到的物理损伤，保证良好的细胞状态；振荡消化可W有效缩短 消化时间，仅消化30分钟就可W得到小的跟腫组织块，消化效率高。【附图说明】 图1为本专利技术实施例1各实验组和对照组细胞岛数量图。图2为原代细胞在培养皿中的形态图。 阳0%] 图3为原代细胞显微形态图。 图4为第3代细胞显微形态图。 图5为流式检测图。【具体实施方式】 为了更好的说明本专利技术，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本专利技术中所 用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再寶述。 主要试剂及仪器分别购自如下公司：I型胶原酶购自sigma公司，泊洛沙姆（F68) 购自Gibco公司，FBS购自Gibco公司，L-DMEM购自Gibco公司，青霉素&链霉素购自sigma 公司，离屯、机购自eppendcxrf公司，显微镜购自尼康公司，恒溫培养箱购自SANYO公司。 实施例1、人跟腫来源肌腫干细胞原代分离消化液及分离方法 人跟腫组织预处理：在无菌环境下用PBS清洗人跟腫组织3次，将5g人跟腫组织 剪切成约ImmXlmmX1mm大小组织碎块；人跟腫组织来自腫断裂患者行跟腫缝合修补术时 修剪的跟腫组织； S1、将500mg人跟腫组织碎块与6血消化液混合，37 °C振荡消化30min;所述消化 液为含表面活性剂的I型胶原酶溶液，所述消化液中I型胶原酶的浓度为3mg/mU表面活性 剂的浓度和振荡转速按照表1所示设置； S2、1500;rpm离屯、lOmin终止消化，弃上清，10血PBS重悬沉淀，用70μm滤器过滤 获得单细胞悬液，300g离屯、5min，弃上清，用lOmL完全培养基重悬细胞沉淀，500个/cm2细 胞密度接种至直径10cm的培养皿中，于37°C，5 %C〇2环境下培养8d细胞贴壁，弃去培养液， 即得到人跟腫来当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种跟腱来源肌腱干细胞原代分离消化液，其特征在于，所述消化液为含表面活性剂的酶溶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，黄幸，李平，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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