检测高密度脂蛋白胆固醇含量的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种检测高密度脂蛋白胆固醇含量的试剂盒，采用优化浓度和比例的聚乙烯硫酸三钾(polyvinylsulphate K-salt,PVS)和聚乙二醇独甲醚(Methoxypolyethylene glycol，PEGME)，联合对高密度脂蛋白胆固醇反应性较好的表面活性剂进行特异性的高密度脂蛋白胆固醇的含量测定。本发明专利技术的技术方案中均无需标本前处理即沉淀和离心，可以直接在自动生化仪测定标本中的高密度脂蛋白胆固醇。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是申请号为200910117837. 3,申请日为2009年3月6日，专利技术名称为"高 密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇定量法"的中国专利申请的分案申请。
本专利技术设及对高密度脂蛋白胆固醇的改良测定方法及相关试剂盒。
技术介绍
血浆中胆固醇的存在和运输形式为血浆脂蛋白，即血浆中非极性的脂类包括胆固 醇和亲水性的载脂蛋白结合，使得脂蛋白有较强的水溶性可W在血中运输。血浆脂蛋白可 W分为高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜颗粒四种，其中低密度脂蛋白 主要负责将胆固醇运输至外周组织，而高密度脂蛋白是清除动脉壁上的胆固醇向肝脏运 输。流行病学和临床研究表明，低密度脂蛋白胆固醇水平与动脉硬化类疾病冠屯、病的发生 率成正相关，高密度脂蛋白胆固醇与动脉硬化类疾病冠屯、病的发生率成负相关，即具有抗 动脉硬化活性。因此高密度脂蛋白胆固醇皿心(：、低密度脂蛋白胆固醇LDkC是当前临床实 验室血脂测定中最有价值的屯、脑血管疾病的危险因素指标。 测定高低密度脂蛋白胆固醇的方法很多，包括超离屯、法、色谱法、电泳法和沉淀法 等。超离屯、法可作为基本的定量法使用，它使用超速离屯、机进行分离，根据比重的差别分离 LDL或皿以进而测定其中的胆固醇含量；而后来发展的电泳法W醋酸纤维膜或琼脂糖凝胶 等做载体分离，然后根据酶法测定胆固醇含量；在沉淀法中，沉淀剂凝结除高密度脂蛋白W 外的脂蛋白，凝结的脂蛋白通过离屯、分离沉淀，根据酶反应测定上清即高密度脂蛋白胆固 醇的含量；测定低密度脂蛋白胆固醇的第一代化学沉淀法，采用PVS和PEGME沉淀LDL，用 离屯、分离法收集沉淀物，然后根据酶反应测定其中的胆固醇含量；W上方法均需要特殊仪 器，包括超速离屯、机、电泳仪和离屯、机等，操作复杂，难于自动化，从而无法在临床实验室开 展。
技术实现思路
本专利技术所设及的直接测定高密度脂蛋白胆固醇的方法，是用优化的聚乙締硫酸Ξ 钟PVS化学沉淀法联合对高密度脂蛋白胆固醇反应性较好的第一表面活性剂，采用优化浓 度的聚乙締硫酸Ξ钟（PV巧和聚乙二醇独甲酸（PEGM巧联合其他化合物将皿LW外的脂蛋 白胆固醇包裹不溶于水但又不至于沉淀，在对高密度脂蛋白胆固醇反应性较好的第一表面 活性剂的作用下溶解高密度脂蛋白胆固醇利用酶反应测定其中胆固醇的含量。本方法所设 及的直接定量低密度脂蛋白胆固醇的方法，采用优化的PVS沉淀法，仅包裹LDL使其无法参 与酶反应，但不会沉淀LDL即形成不溶物，然后LDL中的胆固醇成分在第一和第二表面活性 剂的联合作用下直接测量；详细而言，即高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒中的胆 固醇在对低密度脂蛋白W外的脂蛋白胆固醇反应性较好的第一表面活性剂的作用下参与 胆固醇脂酶反应，低密度脂蛋白胆固醇在第二表面活性剂的作用下溶解释放W进行酶反应 法测定其胆固醇含量。酶反应中第一步产生的过氧化氨不必使用过氧化物酶去除，所w在 第二步中不必加入抑制过氧化物酶活性的叠氮钢。本专利技术中可W使用生物防腐剂。本专利技术 的方法中均无需标本前处理即沉淀和离屯、，可W直接在自动生化仪测定标本中的高密度脂 蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。 本专利技术所用的优化的聚乙締硫酸Ξ钟PVS化学沉淀法即优化浓度和比例的PVS和 PEGME，在检测高密度脂蛋白胆固醇时，其优化后的PVS:PEGME比例为1 :500-550,浓度分别 为10-20mg/L和5g-llg/L;同时可W联合特殊的化合物将LDLVLDL和CM包裹不溶于水但 又不至于沉淀，所用的化合物为对低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳靡颗粒亲和性较好 的化合物，包括聚阴离子、环糊精硫酸盐、葡聚糖硫酸盐和皂巧类化合物等，运些物质的使 用量不受特别限制，根据物质种类及组合方式而不同，尽量选用凝结或混浊少的组合；为进 一步提高特异性，还可W同时添加二价的金属离子盐，包括0. 的儀盐、巧盐等，优 先选用儀盐。 直接测定低密度脂蛋白胆固醇时，采用优化浓度和比例的PVS和阳GME包裹LDL 优化后的比例为1 :400-500,浓度分别为l-20mg/L和4g-10g/L;同时为了避免VLDL的 共同被包裹，采用能掩蔽二价阳离子的金属馨合剂包括邸TA或EGTA等，其使用浓度为 0. ;其他只要是和低密度脂蛋白亲和性较强的化合物，可W是促使其凝聚的聚阴离 子、肝素钢、憐鹤酸、环糊精硫酸盐等，或对其有较强亲和力又不导致沉淀产生的皂巧类化 合物也可W使用，它们可W单独使用或两种或W上组合使用，运些物质的使用量不受特别 限制，根据物质种类及组合方式而不同，尽量选用凝结或混浊少的组合；同时为了生化仪的 维护要求，尽量不使用或使用低浓度的儀离子。 对于第一表面活性剂的选用，可W是离子或非离子的选择性表面活性剂，可W是 对高密度脂蛋白有较好反应性的表面活性剂或对低密度脂蛋白W外的脂蛋白有较好反应 性的表面活性剂，如聚氧乙締类衍生物或聚氧乙締-聚氧丙締的缩合物，包括聚氧乙締高 级醇酸、聚氧乙締月桂基酸、聚氧乙締十六烷基酸、聚氧乙締油基酸、聚氧乙締烷基酸、聚氧 乙締烷基苯基酸、聚氧乙締亚烷基苯基酸、聚氧乙締亚烷基Ξ苯基酸或聚氧乙締烷基酸硫 酸盐等。对于第二表面活性剂的选用，其是可W与所有脂蛋白反应或至少可W与低密度脂 蛋白反应的表面活性剂，如L121，或TritonX100、Tween20、lipominLA、Anhitol24B和胆 酸等。作为运些表面活性剂的商业上可得到的产品实例，包括Emu1gen系列如Emu1gen108、 Emulgen220、Emulgen913、Emulgen709、EmulgenB66、EmulgenA60 (或A6 系列）、Emulgen A90(或A9 系列）、Emulgen911、Emulgenk40 等，和pluronic系列如PluronicF88、 PluronicF68、PluronicL121、PluronicL123、PluronicLlOUPluronicL108等和Triton XlOO等。运些表面活性剂可W单独使用或者两种或W上组合使用。运些表面活性剂的用量 没有特别限制，一般来说，表面活性剂的浓度优选为0. 01%- 3%w/v之间。特别优选的浓 度为 0. 05% -1%w/v。 胆固醇反应应用胆固醇醋酶和胆固醇氧化酶进行，生成的过氧化氨在过氧化物 酶作用下用4-氨基安替比林和高敏感度色原进行吸光度分析测定，并计算出高密度脂蛋 白胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇的含量。作为商业上可得到的色原包括日本同仁化学的 N-乙基-N- (2-径基-3-横丙基）-间苯甲胺灯00巧、N- (2-径基-3-横丙基）-3, 5-二甲 氧基苯胺（HDA0S)、N-乙基-N-(3-甲基苯基）-Ν'-班巧酷基乙二胺（EMS巧等。作为运些 色原的浓度，优选0.ImM-lOmM。 用于高密度脂蛋白胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇定量的试剂，除含有W上所属化 合物、表面活性剂、酶及色原等外，其所采用的缓冲液为Goods缓冲液，例如有肥PES、MES、 MCPS和PIPES等。缓冲液的抑为5-10,优选为6-当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定样品中高密度脂蛋白胆固醇的含量的方法，其步骤为：1)用聚乙烯硫酸三钾和聚乙二醇独甲醚接触所述样品；2)在不形成沉淀的条件下，联合至少一种表面活性剂通过酶法测定所述样品中高密度脂蛋白胆固醇的含量；其中所述的聚乙烯硫酸三钾和聚乙二醇独甲醚的比例为1：500至1：550，聚乙烯硫酸三钾和聚乙二醇独甲醚的浓度分别为10‑20mg/L和5g‑11g/L。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙国敬，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11