皮脂细胞培养和使用方法技术

技术编号:12705304 阅读:220 留言:0更新日期:2016-01-14 01:41
本发明专利技术提供培养皮脂细胞的方法,分离的皮脂细胞群,及为筛选抑制或活化脂肪生成的化合物而使用培养的皮脂细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】
本专利技术涉及培养皮脂细胞的方法,及使用培养的皮脂细胞筛选抑制或活化脂肪生 成的化合物的方法。 【
技术介绍
】 在人中,皮脂腺贯穿全部皮肤分布,及以最大丰度见于面部和头皮,及仅在手掌及 脚底缺乏。皮脂腺是在毛囊中分泌油性物质(皮脂)而润滑动物的皮肤和毛发的显微腺。它们随表皮发挥功能而阻止皮肤脱水,保护身体抵御感染及环境的物理,化学和热攻 击。人皮脂的主要成分是甘油三酯和脂肪酸(57. 5% ),蜡酯(26% )和角鲨烯(12% ) 。 皮脂的产生贯穿生命被调控,及随着年龄增长而显著地减少。此相关于皮肤的增加的干 燥和脆性。而且,几种人疾病,诸如寻常痤疮,特应性皮炎,皮脂溢性皮炎和原发性瘢痕性脱 发被认为与皮脂腺的去调节相关。皮脂腺与毛囊和表皮有关键的内部相关性,由于皮脂细胞功能障碍导致毛囊结构 的变性和缺陷皮肤屏障。此在缺乏去饱和脂肪酸的酶的无皮脂突变小鼠中被证明。 此突变体显示发育不全的皮脂腺和皮肤表面脂质特征的改变,其导致慢性炎性反应,脱发 和真皮结瘢。 原代人细胞的成功的生长常常在具有重要临床含义的人生物学的特定领域构成 突破。组织干细胞诸如血和皮肤表皮的干细胞已成功地用于诊所十年。尤其是,表皮 细胞(角质形成细胞)可体外培养,和可有效操作而形成3维表皮。此模型不仅作 为治疗患严重的皮肤损伤的患者的工具,而且提供研究调控人表皮再生和分化的分子机理 的基本手段。 尽管这些伴随其他类型的细胞的进展,尚无用于培养人原代皮脂细胞的成功的方 法。在过去已自成年人面部皮肤和耳廓周区建立人皮脂腺细胞系,但它们的用猿 猴病毒-40大T抗原或HPV16/E6E7基因(其绕过p53和成视网膜细胞瘤蛋白介导的限制 点)的永生化导致细胞转化,其限制了它们为分析它们的细胞周期和分化调节的使用。因 而,对于培养人原代皮脂细胞的方法仍有需求。【专利技术概述】 本公开提供培养原代皮脂细胞的方法,其包括在适合于培养皮脂细胞的细胞培养 基中培养玻璃片之间所夹的皮脂腺经对于在所述皮脂腺上形成皮脂细胞足够的时间长度。 方法可还包括自皮脂腺移出皮脂细胞,及在适合于培养皮脂细胞的培养基中,在经细胞外 基质蛋白包被的玻璃上培养皮脂细胞。用于培养原代皮脂细胞的本公开的方法还包括在包含基础培养基,表皮生长因 子,霍乱毒素,腺嘌呤,胰岛素,氢化可的松,胚胎牛血清,及抗生素/抗有丝分裂剂的培养 基中,在纤连蛋白包被的玻璃上培养原代皮脂细胞。 本公开的另一方面提供由本公开的方法获得的分离的培养的皮脂细胞群。 本公开的另外的方面提供鉴定调控脂肪生成的化合物,或测定测试化合物对脂肪 生成的效应的方法,包括:(a)将测试化合物添加到由本公开的方法获得的培养的皮脂细 胞群,及(b)测量测试化合物对皮脂细胞中脂质产生的效应。 本公开的这些和其他方面写入随附的权利要求中,及更详细描述于本公开的详述 中。 【【附图说明】】 图la~lc显示皮脂腺的照片和Id显示分离方法。 图2a~h显不脂质分析中涉及的基因表达的图。 图3a~3c显示皮脂腺的照片。 图4a~4f显示TGF0信号传导对皮脂细胞分化的效应的图。 图5a~5d显示稳定地表达针对TGFβRII的shRNA的皮脂细胞中TGFβ信号传 导的抑制的效应的照片。 图6显示人皮脂腺和毛囊的图。 图7a~7g显示人头皮,乳房,胸和面部组织中皮脂腺分化的标志物的表达的照 片。 图8a~8c显示在用亚油酸处理之前及之后原代皮脂细胞和脂质含量的照片。 图9a和9b显示源于乳房或面部皮肤的皮脂细胞中脂肪酸去饱和酶2 (FADS2)和 PPARy表达的图。 图10a和10b显示原代SSG3细胞中TGF0信号传导的抑制。 【专利技术详述】 本公开提供不用转化,及使用无滋养层的培养系统而培养人原代皮脂细胞的方 法。培养及成功地传代人原代皮脂细胞的新方法克服了上皮细胞培养领域中的主要障碍。 在本公开的方法的实践中,从自供体的皮肤样品切下皮脂腺,及培养足够的时间 直到在腺上皮脂细胞形成。 皮脂腺可自皮肤样品由任何适合的过程切下。例如,皮肤样品可切为小块及用分 散酶处理而使真皮与表皮分离。在分散酶处理之后,完整皮脂腺用显微手术仪器在解剖显 微镜下分离。优选地,保留皮脂腺带的毛干和少量的组织,以保存腺周围的微环境。 本公开的方法中使用的皮肤样品可从皮肤含有皮脂腺的人身体的任何位置得到。 已建立原代皮脂细胞培养物来源的头皮,乳房,胸及面部皮肤。优选地,皮脂细胞来自人小 儿供体(自新生儿到小于约15岁的年龄的供体)。 然后将含有皮脂腺的外植体夹入玻璃片,诸如玻璃盖玻片之间,如显示于图Id。优 选地,玻璃经细胞外基质蛋白包被。优选的细胞外基质蛋白是纤连蛋白,优选人纤连蛋白。 通过使用常规方法制备覆盖纤连蛋白的玻璃盖玻片(在本文也称为纤连蛋白包 被的玻璃和类似术语)。包被中人纤连蛋白的量可改变,但是优选约l〇yg/ml。盖玻片可 通过在盖玻片上添加纤连蛋白来包被纤连蛋白,并将盖玻片于室温放置1小时或于4°C过 夜。盖玻片然后用1XPBS缓冲剂洗涤3次,于4°C存储不超过1周。 然后将夹入玻璃盖玻片之间的皮脂腺外植体在皮脂细胞培养基中培养,直到皮脂 细胞生长出皮脂腺。在培养外植体约1~2周后,皮脂细胞自皮脂腺小叶周边变得明显。在 含5 %二氧化碳的37 °C温育器中培养细胞。 皮脂细胞培养基是适合于培养皮脂细胞的细胞培养基,包括本领域已知的皮脂细 胞培养基。 优选的皮脂细胞培养基包含基础培养基,DMEM/Ham'F-12(3:l),其补充有表 皮生长因子(EGF3ng/ml,AustralBiologicalsSanRamon,California),霍乱毒素 (1· 2X10 1QM,SigmaChemicalCo,St.louis,Missouri),腺噪呤(24μg/ml,Sigma), 胰岛素(lOng/mlSigma),氢化可的松(45. 2ng/ml,Sigma),胚胎牛血清(FBS) (2. 5 % Hyclone,Logan,Utah),抗生素/抗有丝分裂剂(青霉素/链霉素)(100X,Invitrogen,Ca rlsbad,California),如描述于。 抗生素青霉素和链霉素的组合用于防止细胞培养物的细菌混杂,由于它们分别针 对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的有效作用。两性霉素B用于防止细胞培养物的真菌混 杂,由于其抑制多细胞真菌和酵母。 皮脂细胞在皮脂腺外植体上形成之后,将皮脂细胞从外植体除去,及将分离的细 胞在纤连蛋白-包被的玻璃,诸如玻璃盖玻片上培养。为了扩展细胞,使用磷酸盐缓冲液溶 液(PBS)中0.05%胰蛋白酶-EDTA(GIBC0,Carlsbad,California)分散细胞。将皮脂细胞 放进用纤连蛋白10μg/ml包被的新的12mm板中的培养物中。细胞可传代达约10次,之后 细胞会逐渐老化。在本文公开的方法中优选使用低代P2-P6细胞。当扩展皮脂细胞时,它 们不需要放置在2个盖玻片之间。当细胞达到80~90%汇合时,它们可扩展。对于培养细 胞而言,20~30 %的密度可为优选的。在少传代之后,无需纤连蛋白-包被的盖玻片,皮脂 细胞可在塑料上生长,但在纤连蛋白-包被的盖玻片上培本文档来自技高网...

【技术保护点】
培养原代皮脂细胞的方法,其包括在适合于培养皮脂细胞的细胞培养基中培养玻璃片之间所夹的皮脂腺经对于在所述皮脂腺上形成皮脂细胞足够的时间长度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员:G·高舍A·J·麦克奈尔恩
申请(专利权)人:儿童医院医疗中心
类型:发明
国别省市:美国;US

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