一种鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种可鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用AGL-ELISA试剂盒，包括包被8BF蛋白的酶标板和酶标记的重组蛋白[AGL]n，重组蛋白[AGL]n为将金黄色葡萄球菌A蛋白免疫球蛋白结合结构域中B结构域、链球菌蛋白G蛋白免疫球蛋白结合结构域中C2结构域、大消化链球菌蛋白L蛋白免疫球蛋白结合结构域中B3结构域这三种蛋白结构域进行基因优化和串联，形成的多拷贝重组蛋白，n为1、2或3。本发明专利技术重组蛋白[AGL]2进行酶标记，酶标记产物经Western-blot、ELISA检测，可与多物哺乳动物免疫球蛋白结合，可作为各种哺乳动物血清学检测中通用抗体，可替代物种特异性抗体，进行多物种共患传染病检测。AGL-ELISA可检测多种动物口蹄疫感染，并能鉴别疫苗免疫和自然感染动物以及持续感染动物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种试剂盒，特别涉及一种一种鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通 用ELISA试剂盒，属于生物

技术介绍
SPA、SPG、PPL都是典型的免疫球蛋白结合蛋白，可以与人和多种动物免疫球 蛋白结合，结合能力和结合谱不同。SpA，SpG和PPL的单结构域已被证实有结合Ig的 作用(JanssonBirger,UhlenMathias,NygrenPerAke.Allindividualdomains ofstaphylococcalproteinAshowFabbinding.FEMSImmunology&Medical Microbiology, 2006, 20(1)。先前报道认为SPA只能结合鼠IgG的Fc区域，SPG既能结合 Fc区域又能结合Fab区域，并且认为SPA、SPG与Fc的结合位点是重叠的。但是Aybay,C 等用木瓜蛋白酶消化鼠IgG后发现两种蛋白结合Fc区域的结合位点是独立的，并不重叠 (AybayC.DifferentialbindingcharacteristicsofproteinGandproteinAforFc fragmentsofpapain-digestedmouseIgG.IMMUNOLOGYLETTERS, 2003, 85(PIIS016 5-2478 (02) 00262-63):231-235.)。SPA、SPG与免疫球蛋白的重链结合，相反PPL只与多种 哺乳动物IgK轻链结合，而且只与片段区域的可变区的VkI、VkIII、和VkIV亚基结合 而不与重链、IgA轻链和κ链的Q区域结合。PPL与人18六132、04、1亚型和大鼠1861 的结合能力是SPA、SPG所无法比拟的。PPL有5个同源性Ig结合区域（B1-B5)每个区域 有72-76个残基。尽管B1结构域初始残基有些无序，它的C末端62个残基形成一个非常 牢固的区域（Tm~70°C)，由一个a螺旋贯穿四个β折叠构成。 根据SPA、SPA、PPL的免疫球蛋白结合区域的特性与互补性，早在1994就 有学者选择L蛋白4个重复结构域B1-B4和蛋白G两个IgGFc结合结构域，构建融 合蛋白LG，并用来纯化鼠科动物的IgG和IgG片段的单克隆抗体（GSvenssonH.，R HoogenboomΗ. ,USjobring.ProteinLA,anovelhybridproteinwithunique single-chainFvantibody-andFab-bindingproperties. .EuropeanJournalof Biochemistry，1999, 258⑵），这些融合蛋白高效而且通用，可以作为强有力的结合介 质，用来鉴定、纯化抗体和抗体片段。但并未证实融合后的结构域是如何发挥作用，是协 同作用还是抑制作用。2008年Yanghua构建了两种单结构域融合的新型免疫球蛋白 结合分子PA(A) -PG和PA(A) -PL，对hlgG/hlgGl-Fc和hlgM/hlgA展现出很强的结合能 力，经竞争性抑制试验证实PA(A)-PG和PA(A)-PL分子发挥协同结合的优势和结合性能 (HuaYang,JieCao,Lian-QingLietal.Evolutionalselectionofacombinatorial phagelibrarydisplayingrandomly-rearrangedvarioussingledomainsof immunoglobulin(Ig)-bindingproteins(IBPs)withfourkindsofIgmolecules. BMCMicrobiology，2008, 8(1))。 本专利技术选金黄色葡萄球菌A蛋白免疫球蛋白结构域中B结构域、链球菌蛋白G蛋 白免疫球蛋白结合结构域C2结构域、大消化链球菌蛋白L蛋白免疫球蛋白结合结构域中B3 结构域进行基因优化设计，把三种蛋白结构域串联，形成多种拷贝，在大肠杆菌中实现可溶 性高效表达，选择表达量高与免疫球蛋白结合能力强的2拷贝体进行酶标记。标记产物经 Western-blot、ELISA检测，可与多物哺乳动物免疫球蛋白结合，可作为血清学检测中通用 抗体，可替代单一抗体，进行多物种布鲁氏菌检测。改善的AGL-ELISA可检测口蹄疫感染， 并能鉴别疫苗免疫和自然感染动物以及持续感染动物。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用ELISA 试剂盒，该试剂盒可检测多种动物口蹄疫感染，并能鉴别诊断出疫苗免疫和自然感染动物 以及持续感染动物； 本专利技术第二个目的在于一系列所述重组蛋白n，HRP酶标记的重组蛋白 2可以特异地与多种哺乳动物免疫球蛋白反应，并且可以作为第二抗体用于多种动物 传染病的血清学检测方法中； 本专利技术的第三个目的在于提供一种制备所述重组蛋白J^方法； 本专利技术的第四个目的在于提供所述AGL-ELISA试剂盒在制备检测多种动物共患 传染病、非共患传染病以及哺乳动物免疫球蛋白试剂中的应用。 为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案： -种检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的AGL-ELISA试剂盒，其特征在于，包括包 被8BF蛋白的酶标板和酶标记的重组蛋白n; 其中，所述重组蛋白n为将金黄色葡萄球菌A蛋白免疫球蛋白结构域中B结 构域、链球菌蛋白G蛋白免疫球蛋白结合结构域中C2结构域、大消化链球菌蛋白L蛋白免 疫球蛋白结合结构域中B3结构域这三种蛋白结构域进行基因优化和串联，形成的多拷贝 重组蛋白，η为1、2或3。 在本专利技术中，优选的，所述的多物种为牛、羊、猪以及鹿；所述的鉴别诊断口蹄疫病 毒感染是指通过检测口蹄疫病毒非结构蛋白（NSP)产生的抗体来达到区分疫苗免疫动物 与口蹄疫病毒感染动物的目的。 进一步的，本专利技术提供了所述重组蛋白n的制备方法： (1)重组蛋白n基因的设计与串联 ①选取金黄色葡萄球菌蛋白A的B结构域、链球菌蛋白G的C2结构域和大消化链 球菌蛋白L的B3结构域，设计可在大肠杆菌表达系统中高效表达的B-SPA、B-SPG和B-PPL 基因序列，并采用重叠延伸PCR方法合成出B-SPA和B-SPG基因，人工合成B-PPL基因，所 述B-SPA、B-SPG和B-PPL基因的核苷酸序列分别如SEQIDN0:3、SEQIDN0:4和SEQID NO:5所示； ②将合成的B-SPA和B-SPG基因分别与pMD18-T载体连接，连接产物转化TGI感 受态细胞，挑选阳性克隆，酶切、PCR鉴定和测序，得到重组质粒PMD18-T-B-SPA和重组质粒 PMD18-T-B-SPG;将合成的B-PPL基因与同样用Xhol、Bglll酶切的pJWF载体连接，连接产 物转化TG1感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切、PCR鉴定和测序，得到重组质粒pJWF-B-PPL; ③重组质粒pMD18-T-B-SPA用Bglll和XhoI进行双酶切，酶切产物B-SPA与同样 双酶切的pET-30a(+)载体连接，连接产物转化TG1感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切鉴定， 得到重组质粒pET-30a(+) -B-SPA;重组质粒pMD18-T-B-S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别诊断口蹄疫病毒感染的多物种通用AGL‑ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被8BF蛋白的酶标板和酶标记的重组蛋白[AGL]n；其中，所述重组蛋白[AGL]n为将金黄色葡萄球菌A蛋白免疫球蛋白结构域中B结构域、链球菌蛋白G蛋白免疫球蛋白结合结构域中C2结构域、大消化链球菌蛋白L蛋白免疫球蛋白结合结构域中B3结构域这三种蛋白结构域进行基因优化和串联，形成的多拷贝重组蛋白，n为1、2或3。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王君伟，高明春，彭统全，李迪，马波，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23