本发明专利技术公开了甲酸切割位点肽及其相关生物材料与它们在生产降钙素中的应用。本发明专利技术所提供的甲酸切割位点肽，名称为CA3，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的肽。利用本发明专利技术的甲酸切割位点肽CA3作为甲酸切割位点构建的融合蛋白，在如下甲酸切割条件下的切割率为85.3％：甲酸(切割剂)浓度为40％(体积百分比)，切割温度为43℃，切割时间为2.5h。含有本发明专利技术的甲酸切割位点肽CA3的融合蛋白进行甲酸切割生产目的蛋白，甲酸切割时间短且切割效率高，有效提高融合蛋白的切割效率，节约了目的蛋白的纯化成本，为蛋白重组的工业生产开启新的思路，为蛋白产品的生产提供技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中甲酸切割位点肤及其相关生物材料与它们在生产降 巧素中的应用。
技术介绍
重组表达具有表达速度快、成本低、生产效率高等优点使其成为多肤合成的便捷 方法。蛋白重组表达的关键技术是目的蛋白的纯化，重组表达一般采用融合蛋白的表达方 法，因此，目的蛋白从融合蛋白上切割分离下来是重组表达的关键，对于蛋白产品而言融合 蛋白的切割和分离效率显得格外重要。目前融合蛋白的切割反应主要有化学切割和酶切割 两种。 酶解的方法相对来说反应条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都 具有高度的特异性。位点特异性蛋白酶（例如凝血酶、肠激酶、Xa因子等）通常被用来切 割融合蛋白。凝血酶在送H种酶中是特异性活性最高的，能够有效切割质量比仅为1:2000 的蛋白，但酶切效率非常低，在用于切割时只有10%的酶能发挥切割功能。肠激酶的专一 性是上述H种中最好的，但由于切割效率低（通常要求质量比达到1:10)而显得比较昂贵。 Xa因子似乎对于切点周围的序列很敏感，经常会出现特异性位点切割不理想却发生别的位 点被切割的情况。更重要的是蛋白酶本身能混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复 杂性。 相对于酶学切割，化学切割在融合蛋白的切割中效率更高，成本低廉、操作简便， 并且在融合蛋白切割中没有新的蛋白引入，样品纯化更加简单，因此成为研究的热点。目 前，广泛应用的化学切割方法主要有W下几种： 漠化氨（CNBr)切割法，CNBr通过切割Met残基駿基端分离融合蛋白。优点是成 本低且有效；缺点CNBr在有Met存在下即可切割蛋白，裂解位点的特异性低，可能对目的蛋 白产生不必要修饰。 居胺（畑2地）切割法，畑20H可专一性切割多肤中的肤键Asn-Gly。优点是不会带 来异源污染，成本相对较低。缺点是居胺不稳定、易分解，且毒性较大。 基于Ca2+的肤键Asp-Pro切割法，优点是切割时间快，30分钟内就可W完成切割； 缺点是对切割体系要求严格，切割溶液中除所需离子外其它离子存在时切割效率明显降 低，成本高，操作步骤繁琐。 肤键D-P(Asp-Pro)的甲酸切割法。在酸性条件下，D-P键被切开是亲核攻击的结 果（MariaHiuveson,ErikRries, 2000)。BenjaminD.等度enjaminD, 1989)已在实验中证 明在酸性条件下发生断裂的仅为D-P键，原理是低抑时Pro的侧链环会发生质子化，而激 发Asp残基上的目碳基团会对其a碳基团发起亲核攻击，从而使D-P键断开。Asp-Pro甲 酸切割法的优点有W下H个；（1)只在酸性条件下才能完成切割，且低抑可W限制性地切 害IjD-P键，不会对其他肤键产生影响；（2)在绝大多数蛋白中D-P出现的概率非常低；(3)对 溶液环境要求较低，溶液中其他离子的存在不影响切割效率，可通过适当提高温度来增加 切割效率。主要的缺点与不足之处包括两点；（1)切割时间相对较长，一般完成全部切割需 为30小时左右；（2)低抑可能影响蛋白的活性和稳定性。 骨质疏松严重威胁人类健康，降巧素（calcitonin,CT)是目前治疗骨质疏松一线 药物，临床应用已近30年，目前国际市场的年销售额达7亿美元。价格昂贵是影响降巧素 广泛应用的主要原因，目前中国国内注射针剂中的降巧素为5200元/毫克，原药价格也高 达0. 8-1. 0万元/克。降巧素价格昂贵的原因是：目前临床上应用的降巧素主要是化学合 成法生产的，具有副产物多和难W大规模生产的问题。基因工程法在大肠杆菌或酵母中表 达的降巧素，由于C-端32位氨基酸不能醜胺化，生物学活性很低，每毫克只有100-200国 际单位，无法应用于临床，W上两个原因导致目前降巧素的市场价格很高。油体表达体系的 原理是使目的蛋白插在种子的油体表面，构成融合蛋白，在转基因植物种子的油体上特异 表达，利用油体亲脂疏水的特性，将种子粉碎一离必一回收上层油相一去油，即可获得融合 蛋白。该方法具有提取工艺简单，易于分离纯化的优点，还可大大提高农副产品的附加值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种甲酸切割时间短且切割效率高的甲酸切 割位点肤CA3及其应用。该甲酸切割位点肤有效提高融合蛋白的甲酸切割效率，节约目的 蛋白的纯化成本。含有CA3的融合蛋白最佳甲酸切割条件是甲酸浓度为40% (体积百分 比），切割温度为43°C，切割时间为2.化。 本专利技术所提供的甲酸切割位点肤，名称为CA3,是氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示 的肤。 其中，SEQIDNo. 2由6个氨基酸残基组成。 含有CA3的融合蛋白也属于本专利技术的保护范围。上述含有CA3的融合蛋白WCA3 作为甲酸切割位点用于从所述融合蛋白中切割分离目的蛋白。 上述融合蛋白中，所述融合蛋白是降巧素融合蛋白G-sCT-SO,所述降巧素融合蛋 白G-sCT-SO是将糖蛋白膜外区和降巧素连接形成的融合蛋白G-SCT与芝麻油体蛋白连接 形成的蛋白质；所述融合蛋白G-SCT是由甲酸切割位点肤将所述糖蛋白膜外区和所述降巧 素连接形成的融合蛋白；所述甲酸切割位点肤的氨基酸序列是SEQIDNo. 2。[001引所述降巧素融合蛋白G-sCT-SO的氨基酸序列具体可为SEQIDNo. 4。 下述与甲酸切割位点肤CA3相关的生物材料、或与所述融合蛋白相关的生物材料 也属于本专利技术的保护范围： 与甲酸切割位点肤CA3相关的生物材料为BI) -B12)中的任一种：BI)编码甲酸切割位点肤CA3的核酸分子；B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒； B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； B5)含有BI)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物； B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物； B9)含有BI)所述核酸分子的转基因动物或转基因植物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物或转基因植物细胞系；[002引 Bl1)含有B3)所述重组载体的转基因动物或转基因植物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物或转基因植物细胞系； 与所述融合蛋白相关的生物材料为Cl)-C12)中的任一种： Cl)编码所述融合蛋白的核酸分子；C2)含有Cl)所述核酸分子的表达盒；C3)含有Cl)所述核酸分子的重组载体；C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；C5)含有Cl)所述核酸分子的重组微生物； C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物；C9)含有Cl)所述核酸分子的转基因动物或转基因植物细胞系； CIO)含有C2)所述表达盒的转基因动物或转基因植物细胞系；Cl1)含有C3)所述重组载体的转基因动物或转基因植物细胞系；C12)含有C4)所述重组载体的转基因动物或转基因植物细胞系。[004引其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也 可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。 上述生物材料中，BI)所述核酸分子具体可为编码序列是序列表中SEQIDNo. 3的 第112-129位核巧酸（即SE本文档来自技高网...
【技术保护点】
氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘昱辉，张华光，李梅，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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