本发明专利技术属于生物医学领域，公开了一种基于石墨烯氧化物传感器及其制备方法和应用，具体涉及一种基于Tween 80修饰的石墨烯氧化物——核酸适配体传感器及其检测凝血酶的方法本发明专利技术的技术方案主要包括：1）制备石墨烯氧化物；2）把石墨烯氧化物加入到Tween 80通过自组装修饰后的Au NP标记的核酸适配体上；3）加入不同浓度的凝血酶，通过石墨烯氧化物表面吸附的核酸适配体标记AuNP的紫外吸收强度的变化，进行检测。本发明专利技术充分利用石墨烯氧化物的特性，采用AuNP标记的核酸适配体序列与凝血酶特异性结合，通过AuNP紫外吸收值的变化，能高灵敏度、无标记、低成本地实现凝血酶的微量检测，通过加入Tween 80，将石墨烯氧化物-核酸适配体传感器对凝血酶检测限提高至0.005nM。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域中的蛋白质检测领域，涉及一种基于石墨烯氧化物传感器对凝血酶(thrombin)的检测方法，具体涉及一种基于失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(Tween 80)修饰的石墨稀氧化物(GO) —核酸适配体(aptamer)传感器及其检测凝血酶的方法，属于生物医学领域中的蛋白质检测方法。
技术介绍
人的thrombin是凝血连锁反应的主要效应蛋白酶，thrombin能使纤维蛋白原转化成纤维蛋白。局部应用后作用于病灶表面的血液很快形成稳定的凝血块，用于控制毛细血管、静脉出血，或作为皮肤、组织移植物的黏合、固定剂。thrombin在凝血系统的许多疾病中发挥着关键性作用。过量表达thrombin能够导致血栓形成，但是它若表达不足则可能导致血友病。因此，准确地监控thrombin对于确定给定病人的合适治疗方法是至关重要的(Patthara K., Sunil K., Arya, Chee C.ff., Lee J.0., Mi K.P.Coiled-coil peptidebased sensor for ultra-sensitive thrombin detect1n, B1sens.B1electron.2014，55，26-31 ；Du F.，Alam M.N.，Pawliszyn J.Aptamer-funct1nalized solidphase microextract1n-1iquid chromatography/tandem mass spectrometry forselective enrichment and determinat1n of thrombin, Anal.Chim.Acta 2014，845:45-52.)。GO是单一的原子层，可以随时在横向尺寸上扩展到数十微米，长久以来被视为亲水性物质，从石墨烯薄片边缘到中央呈现亲水至疏水的性质分布，制备简单，成本比较低，从而在生物检测中得到广泛的应用，而且GO在与DNA相互作用时，有一个重要的特点，单链 DNA 通过 Ji 一 Ji 效应，能吸附到 GO 表面(Qian, Z.S.，Shan, X.Y.，Chai, L.J.,Ma, J.J., Chen, J.R., Feng, H., Nanoscale, 2014, 6: 5671 - 5674)，aptamer 是一种单链DNA，能特异性地结合thrombin，当thrombin与aptamer特异结合后，aptamer会脱离GO表面，被检测的thrombin能非特异性地吸附到GO表面，从而阻止检测灵敏性的提高。为发展高灵敏、快速地、低成本地检测thrombin的方法，我们利用Tween 80改善金纳米在缓冲液中的稳定性，缩短金纳米与核酸的链接时间，提高了反应效率并阻止GO表面非特异性吸附的thrombin，提高检测的灵敏度，发展一种灵敏度较高的thrombin的检测方法。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种基于Tween 80修饰的GO传感器及其对thrombin的检测方法，Tween 80能缩短金纳米与核酸的链接时间，提高了反应效率并阻止GO表面对thrombin的非特异性吸附，从而高灵敏、快速、低成本对thrombin进行检测。一种基于石墨烯氧化物传感器，所述传感器为石墨烯氧化物-核酸适配体传感器，是金纳米粒子Au NP表面经Tween 80修饰后，连接核酸适配体，再与石墨稀氧化物结合而成的。一种基于石墨烯氧化物传感器的制备方法，包括如下步骤: (I)制备石墨稀氧化物:通过改良的Hmnmers法制备石墨稀氧化物G0，将石墨稀氧化物GO真空干燥备用，使用前，在水溶液中超声分散，得石墨烯氧化物分散液备用； (2)Tween 80修饰Au NP表面:按照ImL金溶胶中加10 μ I Tween 80的比例，配制分散液Α，反应30min备用；Tween 80通过自组装与Au NP表面相结合，形成一层保护膜，防止Au NP聚集； (3)将凝血酶thrombin的核酸适配体aptamer连接到金纳米粒子AuNP上:在步骤(2)所得的分散液A中，加入核算适配体aptamer，5’ - GG TTG GTG TGG TTG G -3’，5’末端标记巯基(-SH);加热反应2.5 h后，核算适配体aptamer连接到Au NP上，得分散液B ； (4)传感器的构建:将步骤(I)制得的石墨烯氧化物GO分散液加入到步骤(3)所得的分散液B中，即制备成基于核算适配体aptamer的GO传感器；G0能够使Au NP的紫外吸收值降低。步骤(I)中，石墨烯氧化物分散液的浓度为2 mg/ml。步骤(2)中，所述金溶胶的浓度为8-10 nM，所述的Tween 80的浓度为10% ;所述分散液A中的Tween 80的最终体积百分浓度为0.1%。步骤(3 )中，所述分散液B中，核算适配体的最终浓度为120 nM。步骤(4)中，所述GO传感器中，核酸适配体的终浓度为120 nM ;G0的终浓度为40Kg/mL0所述的一种基于石墨烯氧化物传感器应用于检测凝血酶，具体步骤为:在所述传感器中，加入0.005-30 nM的凝血酶，结合凝血酶后，Au NP的紫外吸收值较加入凝血酶前提高了 30%-237.07% ;根据Au NP的紫外吸收值的变化，对其进行检测。所述传感器用于检测凝血酶的检测限可以达到0.005 nM。本专利技术的有益效果为: 1.本专利技术中GO易于获得，方法简单、成本低，充分利用GO能使结合有AuNP的aptamer的紫外吸收值降低，当蛋白质结合单链DNA后，紫外吸收值增加的特点，能无标记、特异性、高灵敏性对thrombin进行检测。2.本专利技术采用Tween 80稳定金纳米在缓冲液中的分散性，大大缩短了金纳米与核酸的链接时间，提高了反应效率，阻止GO对thrombin的非特异性吸附，解决基于GO传感器检测thrombin中的非特异吸附的问题，从而增加检测的特异性，进一步提高检测的灵敏性。【附图说明】图1:本专利技术的流程示意图。图2:基于GO传感器对凝血酶thrombin灵敏性检测图。图3:基于GO传感器对凝血酶thrombin选择性检测图。图4:Tween 80修饰GO传感器对凝血酶thrombin检测的影响图。图5:Tween 80修饰GO传感器对0.005 nM thrombin检测图，图中曲线由上至下依次为 aptamer-AuNP-Tween 80、aptamer—AuNP-GO- Tween 80-0.005 nM thrombin、aptamer-AuNP-GO- Tween 80 检测结果曲线。图6:Tween 80修饰GO传感器对0.0lnM thrombin检测图，图中曲线由上至下依次为 aptamer-AuNP-Tween 80n aptamer—AuNP-GO- Tween 80-0.01 nM thrombin、 aptamer-AuNP-GO- Tween 80 检测结果曲线。【具体实施方式】以下结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，实施例是用于说明本专利技术而不是用于限制本专利技术的范围。图1为本专利技术的流程示意图，结合有Au NP的a本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于石墨烯氧化物传感器，其特征在于，所述传感器为石墨烯氧化物‑核酸适配体传感器，是金纳米粒子Au NP表面经Tween 80修饰后，连接核酸适配体，再与石墨烯氧化物结合而成的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高力，李琴，时海霞，陈亮，周阳，陈克平，张春霞，邓泽斌，李娆琪，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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