本公开涉及变体因子VIII多肽，其在凝血酶切割位点和活化环之一或两者中的一个或多个位置处包含氨基酸取代。在某些实施方案中，该变体因子VIII多肽包含在凝血酶切割位点和活化环两者中的一个或多个氨基酸取代。在进一步的实施方案中，所述变体因子VIII多肽还包含在A1-A2域界面和A2-A3域界面内的一个或多个氨基酸取代。本公开还涉及产生和/或使用这类变体因子VIII多肽的方法：编码该多肽的核酸；含有这类核酸的载体和/或重组细胞、组织或生物体；和含有这类多肽和/或核酸的试剂盒和药物组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】变体因子Vl I I多肽及其产生和使用方法 对相关申请的交叉引用 本申请要求2013年3月15号提交的美国临时申请No. 61/789, 112的权益，其通 过提述完整并入本文。 专利
本文中提供了人凝固因子VIII变体和编码这类变体的多核苷酸，包含和表达这 类变体的载体和宿主细胞，获得这类变体的方法，使用这类变体的方法，变体的组合物，和 与其相关的另外的专利技术特征。 专利技术背景 血液凝固是由多种血液组分（或因子）之间复杂的相互作用组成的逐渐导致纤 维蛋白凝块形成的过程。通常参与被常称为凝固"级联反应"的血液组分是不具有酶活性 的蛋白（原酶或酶原），通过激活剂的作用使其转化为蛋白水解酶，所述激活剂本身常常是 激活的凝固因子。对凝固级联反应关键性的一种肽是因子VIII或FVIII。事实上，最常见 的遗传性凝血病症血友病A是由因子VIII中的缺陷或结构性缺陷导致的。因子VIII的 生物化学允许针对凝固的快速打开/关闭转换。它作为无活性的辅因子循环，通过凝血酶 (凝固级联反应的倒数第二个酶）被活化为FVIIIa。FVIIIa与FIXa、膜或磷脂（PL)表面 和Ca+2-起参与一种短寿命的酶复合物（FXase)以将FX转化成FXa。FVIIIa作为FXase 复合物中的参与者的主要功能是突出地增多FXa，由此允许凝血酶生成。因子VIII由~ 186kb基因编码，该基因由26个外显子组成（Thompson, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 29:11-22 (2003)(参考文献11和16-18))。该基因的mRNA的翻译继之以19个 氨基酸的信号序列的除去，产生2332个氨基酸的成熟蛋白质。该蛋白由6个主要域组成， 其从氨基末端为：AU A2、B、A3、Cl和C2。涉及活化的另外的短酸性区域al、a2和a3分别 散布在Al和A2、A2和B、和B和A3域之间。这一 2332个氨基酸的主要翻译产物被加工成 异二聚体，其由异质性重链（含有完整的Al，alA2，a2域和多种长度的B域）和同质性80kD 轻链（含有a3、A3、Cl和C2域）组成。B域的异质性来自分泌期间的蛋白水解。 因子VIII到因子VIIIa的活化一般经由通过凝血酶对原辅因子（procofactor) 的蛋白水解而发生。凝血酶识别限定沿因子VIII肽链的凝血酶切割位点的特定氨基酸区 域。因子VIII具有3个凝血酶切割位点。对其他凝血酶底物的检查揭示了可被凝血酶容纳 的多个残基。尽管在这些凝血酶切割位点内的氨基酸可在一定程度上变化，但某些氨基酸 比之其他氨基酸在这些切割位点内要更常见得多，且某些氨基酸残基引起凝血酶对该肽的 更有效的切割。（参见例如Newell-Caito 等，"P3_P3'Residues flanking Scissile Bonds in Factor VIII Modulate Rates of Substrate Cleavage and Profactor Activation by Thrombin1Tiochemistry 51:3451-59(2012) ;Gallwitz 等，"The Extended Cleavage Specificity of Human Thrombin,'TLoS ONE 7:e31756(2012))。因子 VIII 中的 3 个凝血 酶切割位点之一位于或接近al-A2接合处，其位于或接近成熟野生型人因子VIII肽的氨基 酸位置370-375处。 在切割后，活性因子Villa是包含Al亚基、A2亚基和A3C1C2亚基的异三聚体。该 异三聚体由在亚基彼此相互作用所在区域处的亚基之间的静电和疏水性相互作用两者支 持，所述区域称为"域界面"。已知该异三聚体包含至少A1-A2和A2-A3域界面。（参见例 如美国专利吣.8,338,571(2008年7月25日提交）（2012年12月25日授权））。 人因子VIII被重组生产为约300kD的单链分子。该前体产物在高尔基体（Golgi Apparatus)中被加工成200kD(重链）和80kD(轻链）的两条多肽链，这两条链通过金 属离子被保持在一起（Kaufman 等，J. Biol. Chem. 263:6352 (1988) ;Andersson 等，Proc. Natl.Acad. Sci.83:2979(1986))。FVIII的B域似乎是可有可无的，因为B域缺失的 FVIII (FVIII-BDD ;90kD A1-A2重链加80kD轻链）已显示为是血友病A的有效替换疗法。 称为"BDD-SQ"或简称为"BDD"的一种公知的B域缺失的因子VIII序列含有除14个氨基 酸以外的B域全部缺失。 对血友病A的治疗目前涉及按需要或作为防护疗法静脉内（iv)施用因子VIII。尽 管对于全长蛋白其有超过300kD的较大大小，但因子VIII在人中的半衰期仅为约11小时。 (Ewenstein等，Semin. Hematol. 41:1-16(2004))。因此，必须相对频繁地施用因子VIII以 用于对凝血病症的防护性治疗。因子VIII通常每周施用两至三次，给药基于因子VIII活 性。这种对频繁iv注射的需要给患者依从性创造了巨大的障碍。如果能开发出不需要那 么频繁施用的因子VIII产品，对于患者将是更方便的。此外，降低需要的剂量数目也会降 低治疗的成本。另外，即使使用这些频繁施用，由于其短半衰期，进行因子VIII替换疗法的 患者也经常在血浆因子VIII活性水平中产生较大的摆动，从而给其带来潜在的血栓症（在 峰值水平）和出血（在低谷水平）的风险。 另外，备选的非iv施用路径如皮下（SC)施用可以通过将血浆因子VIII水平维持 在更恒定的水平既增加治疗的容易性又降低血栓症和出血的潜在风险。Sc投递的一项挑 战是增加施用的因子VIII的生物利用度。具有增强的活性的因子VIII肽可能对于增强 生物利用度有用，因此可能可用于因子VIII的SC投递。由于其较高的比活性（specific activity)，这类因子VIII肽可能允许施用所需体积的减少，因为药物的活性浓度更高。降 低的注射体积能减少患者不适。此外，体积降低还将转化成货品成本的降低。最后，增强的 活性因子VIII分子还能赋予在野生型因子VIII之上的额外保护，其通过延长辅因子活性 的持续时间（如果给药是通过质量（mass)而非通过活性的话）。例如，在等质量给药时，具 有2倍比活性增强的增强活性的FVIII变体在0. 5%水平将提供与野生型FVIII在1 %水 平所提供的相同的保护，由此延长因子VIII剂量之间的时间间期。 已生成大量因子VIII变体以试图解决当前医学疗法的一个或多个缺点。例 如，美国专利No. 8,338,571 (2008年7月25日提交；2012年12月25日授权）描述了一 种重组因子VIII，其包含一个或多个导致因子VIII和因子VIIIa两者的增强的稳定性 的突变。类似地，美国专利公开No. 2012/0190623(2011年1月27日提交）描述了对失 活抗性的因子VIII突变体，包括"其中APC切割位点本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种因子VIII多肽的变体，其中所述因子VIII多肽是包含氨基酸位置370‑375处的凝血酶切割位点和氨基酸位置558‑565处的活化环的功能性因子VIII，其中所述氨基酸位置编号依照SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列；且其中所述变体包含在所述凝血酶切割位点内一个或多个残基处的氨基酸取代和在所述活化环内一个或多个残基处的氨基酸取代。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：U格里特赞，P克雷奇默，L莱昂格，C帕特尔，
申请(专利权)人：拜耳医药保健有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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