构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌与应用技术

技术编号:12590102 阅读:103 留言:0更新日期:2015-12-24 15:24
本发明专利技术涉及一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法,包括如下步骤:(1)选择出发菌株和目的基因;(2)构建包含所述目的基因的表达载体;(3)在步骤(2)中所述目的基因的核糖体结合位点之前插入有绝缘子功能的序列,并且在所述有绝缘子功能的序列之前插入有异源或人工合成启动子序列;(4)将步骤(3)中构建的表达载体导入出发菌。还涉及根据以上方法构建的重组菌及利用所述重组菌发酵生产番茄红素的方法。

【技术实现步骤摘要】
构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌与应用
本专利技术涉及基因工程领域,具体涉及一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌与应用。
技术介绍
自然界中的动植物、微生物可以合成许多具有结构和功能多样性的有机小分子化合物。与蛋白质、核酸、脂类等生物大分子相比,它们并不直接参与生物体的生长和发育,但却具有重要的生物活性及生理功能。人们把这样的活性小分子化合物称为天然产物。许多天然产物在医学上或工农业生产中有重要用途。传统的开发和挖掘活性天然产物方法,如高通量筛选和OSMAC(“onestrainmanycompounds”)手段都已很难发现新颖药物先导化合物(ZhuH,SandifordSK,vanWezelGP(2014)Triggersandcuesthatactivateantibioticproductionbyactinomycetes.JIndMicrobiolBiotechnol41(2):371–386.),与已发掘的化合物分子数相比,已测序的微生物基因组中,仍然存在大量的次级代谢基因未表达,而且这些相关基因在基因组中成簇存在,称为基因簇。这些未表达的基因簇称为“沉默”或“潜在”基因簇,这些沉默基因簇提示着我们,微生物中仍然蕴含着一个等待开发的天然产物宝库(RebetsY,E,TokovenkoB,LuzhetskyyA(2014)Actinomycetesbiosyntheticpotential:Howtobridgeinsilicoandinvivo?JIndMicrobiolBiotechnol.41(2):387–402.)。造成这些基因簇沉默的重要原因之一是:在微生物的基因组中,蕴含大量转录和翻译的调控基因,这些调控基因构成了一个负调控网络,抑制了基因簇的表达。而如何解除这些严密的调控,或利用调控激活沉默基因簇,正是挖掘活性天然产物所遇到的难点。为了激活这些沉默的基因簇,获得活性的天然产物,研究者开发了很多挖掘的方法,大致分为针对菌体细胞的生理刺激和合成或遗传生物学的操作,以及两者兼备(AigleB,CorreC(2012)WakingupStreptomycessecondarymetabolismbyconstitutiveexpressionofactivatorsorgeneticdisruptionofrepressors.MethodsEnzymol.517:343–366.LuoY,etal.(2013)Activationandcharacterizationofacrypticpolycyclictetramatemacrolactambiosyntheticgenecluster.NatCommun.4(4):2894.ZhuoY,etal.(2010)ReversebiologicalengineeringofhrdBtoenhancetheproductionofavermectinsinanindustrialstrainofStreptomycesavermitilis.ProcNatlAcadSciUSA.107(25):11250–11254.)。合成或遗传生物学的操作则针对目的基因采用外源表达元件绕开菌体自身负调控网络,促使目的基因表达。而使用外源表达元件过表达目的基因的工作中,表达元件之间会产生部件交互干扰,特别在强表达元件之间,或各元件在转录和翻译过程中,均会出现一些干扰,从而使得过表达的效果大大降低(LouC,StantonB,ChenY-J,MunskyB,VoigtCA(2012)Ribozyme-basedinsulatorpartsbuffersyntheticcircuitsfromgeneticcontext.NatBiotechnol30(11):1137–1142.)。链霉菌属革兰氏阳性放线菌,在系统生物学上归于链霉菌属(Streptomyces),具有复杂生活周期和次生代谢途径。该属的许多成员都能产生丰富的具有生物活性的次级代谢产物。目前已知的上万种抗生素中,有70%以上是由链霉菌产生的。除此之外,它还能产生免疫抑制剂、抗肿瘤剂、杀虫剂和多种胞外水解酶,如纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和蛋白酶等。(ZhuF,etal.(2011)Clusteredpatternsofspeciesoriginsofnature-deriveddrugsandcluesforfuturebioprospecting.ProcNatlAcadSciUSA.108(31):12943–12948.)这些特性提示我们,链霉菌具有这些类别天然产物的前体代谢途径,是天然产物异源合成的理想宿主之一。目前某些链霉菌已经完成全基因组测序并建立起了标准的遗传操作规程,为天然产物的异源合成提供了便利,如阿维链霉菌Streptomycesavermitilis。番茄红素是一类具有抗氧化能力的二萜化合物,广泛应用于医药保健、食品化工和化妆品产业中(NamithaKK,NegiPS(2010)Chemistryandbiotechnologyofcarotenoids.CritRevFoodSci50:728-760),商用的番茄红素多以番茄或番茄产物为原料,采用多级化学合成和化学萃取获得(LinY,JainR,YanY(2014)Microbialproductionofantioxidantfoodingredientsviametabolicengineering.CurrOpinBiotechnol.26:71-78)。但是,原料受季节和地缘的影响,化学合成的复杂度、有机废物的污染都限制了番茄红素的工业应用。而近年来,随着代谢工程和合成生物学的兴起,研究者们希望利用微生物来发酵生产番茄红素。
技术实现思路
本专利技术提供了一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌与应用,本专利技术的重组菌替换了目的基因原有调控元件,并且消除了启动子与RBS等表达元件之间的干扰,提高了目的基因的表达,从而增加了目的基因产物的产量。本专利技术的一个方面,提供一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法,包括如下步骤:(1)选择出发菌株和目的基因;(2)构建包含所述目的基因的表达载体;(3)在步骤(2)中所述目的基因的核糖体结合位点之前插入有绝缘子功能的序列,并且在所述有绝缘子功能的序列之前插入有异源或人工合成启动子序列;(4)将步骤(3)中构建的表达载体导入出发菌。以上所述的构建方法中,所述出发菌包括野生型或经基因工程改造的原核微生物;优选地,包括大肠杆菌、链霉菌和放线菌。以上所述的构建方法中,所述链霉菌包括野生型链霉菌或经修饰、突变、诱变或基因重组获得的链霉菌;优选地,所述链霉菌为StreptomycesavermitilisMA4680。以上所述的构建方法中,所述目的基因包括原核生物基因组编码的基因,真核生物cDNA中编码的基因。以上所述的构建方法中,所述原核生物基因组编本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)选择出发菌株和目的基因;(2)构建包含所述目的基因的表达载体;(3)在步骤(2)中所述目的基因的核糖体结合位点之前插入有绝缘子功能的序列,并且在所述有绝缘子功能的序列之前插入有异源或人工合成启动子序列;(4)将步骤(3)中构建的表达载体导入出发菌。

【技术特征摘要】
1.一种构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)选择出发菌株和目的基因,所述出发菌为StreptomycesavermitilisMA4680,所述目的基因为crtE基因、crtI基因和crtB基因;
(2)构建包含所述目的基因的表达载体;
(3)在步骤(2)中所述目的基因的核糖体结合位点之前插入有绝缘子功能的序列,并且在所述有绝缘子功能的序列之前插入有异源或人工合成启动子序列,所述异源或人工合成启动子为SP12、SP18、SP23、SP26、kasOp*、SP43或SP44启动子,所述有绝缘子功能的序列为RiboJ序列;
(4)将步骤(3)中构建的表达载体导入出发菌。


2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中采用整合型质粒载体表达所述目的基因。


3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述整合型表达载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pIJ8660。

【专利技术属性】
技术研发人员:张立新胡逸灵娄春波白超弦苗靳向四海黄佩
申请(专利权)人:中国科学院微生物研究所安徽大学
类型:发明
国别省市:北京;11

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