核酸制备和分析的组合物和方法技术

本发明专利技术提供了产生单链多核苷酸的方法，其包括使用接头序列、单链多核苷酸扩增和包含BJSA的引物。还提供了使用探针和单链多核苷酸分析期望的多核苷酸上之一个或更多个区域的方法。还提供了可用于这些方法的试剂盒和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请的交叉引用 本申请要求于2012年12月3日提交的美国临时专利申请No. 61/732,823的优先 权权益，其通过引用W其整体并入。
本申请一般性地设及核酸样品制备和测序领域。
技术介绍
核酸序列分析工具是鉴定基因改变的基础，其进而可用于诊断遗传疾病、预测对 药物治疗的响应性W及分析药物的药物基因组学。由于测序分析经常设及在有限量的样品 中确定稀有的遗传改变，因此灵敏度是一个大的挑战。在分析组织样品（如癌症样品）中 的体细胞突变时尤其如此，所述组织样品经常包含与具有突变之细胞混合的正常细胞。 为了增加灵敏度，使用了多种核酸扩增方法。最常用的扩增方法是聚合酶链式反 应（"PCR")，其设及使用Taq聚合酶来进行多个循环的扩增。因为Taq聚合酶固有的保真 性（fidelity)问题，所WPCR方法经常产生可掩盖待分析之真正突变的人工突变，使得极 难检测样品中的稀有突变。因此，可能降低核酸方法的精确度。 人基因组DNA很复杂并且具有很多重复序列。运为序列分析带来了另外的挑战。 首先，目的多核巧酸在多核巧酸混合物中的代表性可能显著不足。其次，分析复杂DNA样品 的成本可能极其昂贵，特别是在分析基因组DNA和检测多个遗传突变的情况下。虽然已开 发了多种下一代测序方法，但是仍然需要灵敏、精确且有效的核酸制备和测序分析方法。 本文引用的所有参考文献（包括专利申请和出版物）均通过引用W其整体并入。
技术实现思路
在一个方面中，本申请提供了产生包含不对称接头（adaptor)序列的单链多核巧 酸的方法，其包括：i)使一个或更多个DNA片段与W下接头连接：a)包含标签的第一接头， 和b)包含识别序列的第二接头；ii)基于标签的存在选择包含所述第一接头的DNA片段； iii)使用包含RNA并与识别序列杂交的引物通过单链多核巧酸扩增来扩增步骤ii)中选择 的DNA片段，从而选择性扩增包含所述第二接头的DNA片段。在一些实施方案中，通过使双 链祀DNA(例如，基因组DNA)片段化来产生所述一个或更多个DNA片段。在一些实施方案 中，使步骤ii)中选择的DNA片段的一条链与其互补链物理分离后，将其用作单链多核巧酸 扩增的模板。 在一些实施方案中，提供了由双链祀DNA产生包含接头序列的单链多核巧酸的方 法，其包括：i)用限制性内切核酸酶切割双链祀DNAW产生具有5'或3'突出端的DNA片 段；ii)使所述DNA片段与接头连接，所述接头包含：a)与所述DNA片段的5'或3'突出端 互补的单链5'或3'突出端和b)识别序列；W及iii)使用包含RNA并与识别序列杂交的 引物通过单链多核巧酸扩增来扩增与所述接头连接的DNA片段。在一些实施方案中，使与 所述接头连接的DM片段进一步片段化后，对其进行单链多核巧酸扩增。 在根据W上段落所述的任意一个实施方案的一些实施方案中，所述方法还包括由 所述单链多核巧酸制备多核巧酸文库。 在根据W上段落所述的任意一个实施方案的一些实施方案中，所述方法还包括将 所述单链多核巧酸固定在固体支持物上。 在根据W上段落所述的任意一个实施方案的一些实施方案中，所述方法还包括对 所述单链多核巧酸进行分析（例如测序）。 在一些实施方案中，提供了对祀多核巧酸上的一个或更多个期望区域进行分析 (例如，测序）的方法，其中所述一个或更多个期望区域可与探针组杂交，所述方法包括：1) 使由所述祀多核巧酸产生的单链多核巧酸群与探针组相接触；2)使与探针结合的多核巧 酸与其余的多核巧酸分离，其中包含一个或更多个期望区域的多核巧酸被富集；3)对分离 的多核巧酸进行分析（例如，测序）。在一些实施方案中，使用包含RNA的引物并使用由所 述祀多核巧酸产生的DNA片段作为模板通过单链多核巧酸扩增而由所述祀多核巧酸产生 单链多核巧酸群。在一些实施方案中，所述一个或更多个期望区域是癌基因所在的区域。在 一些实施方案中，探针组包含至少约10种不同的多核巧酸探针。在一些实施方案中，多核 巧酸探针组包含至少约50种不同的多核巧酸探针。在一些实施方案中，祀多核巧酸是RNA。 在一些实施方案中，祀多核巧酸是双链DNA(例如，基因组DNA)。在一些实施方案中，单链多 核巧酸群通过W上段落所述的方法来产生。 在根据上述任意一个实施方案的一些实施方案中，单链多核巧酸扩增包括：a)在 复合体中延伸包含RNA的引物，所述复合体包含：i)待扩增的DNA片段和ii)包含RNA的 引物，其中使所述包含RNA的引物与所述待扩增的DNA片段杂交；W及b)用从RNA/DNA杂 合体切割RNA的酶切割引物的RNA部分，W使得另一包含RNA的引物与DNA片段杂交并通 过链置换来重复引物延伸；从而产生单链多核巧酸的多个拷贝。 在根据上述任意一个实施方案的一些实施方案中，单链多核巧酸扩增包括使用 RNA引物。在一些实施方案中，单链多核巧酸扩增包括使用DNA-RNA复合引物。在一些实 施方案中，延伸通过选自W下的DNA聚合酶来进行：链置换DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、 具有校正活性的聚合酶、T7 DNA聚合酶和大肠杆菌化coli)DNA聚合酶。在一些实施方案 中，从RNA/DNA杂合体切割RNA的酶是RNase H或RNase I。 在一些实施方案中，提供了运样的试剂盒，其包含i)包含标签的第一接头；和b) 包含识别序列的第二接头；和iii)与所述识别序列杂交的引物。在一些实施方案中，试剂 盒还包含与所述标签结合的配体。在一些实施方案中，试剂盒还包含固体支持物。在一些 实施方案中，引物包含RNA。在一些实施方案中，引物是RNA引物。在一些实施方案中，引物 是DNA/RNA复合引物。在一些实施方案中，引物为约5至约30个核巧酸。在一些实施方案 中，试剂盒还包含从RNA/DNA杂合体切割RNA的酶（例如，RNaseH或RNaseI)。在一些实 施方案中，试剂盒还包含DNA聚合酶，例如，选自W下的DNA聚合物：链置换DNA聚合酶、高 保真DNA聚合酶、具有校正活性的聚合酶、T7DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶。在一些 实施方案中，试剂盒还包含DNA连接酶。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或更多种探 针。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于进行任意一种本文所述方法的说明书。【附图说明】 图1描绘了使用不对称接头处理DM的一种示例性方法。 图2描绘了使用限制性酶消化处理DNA的一种示例性方法。 专利技术详述 本申请提供了核酸制备和分析的方法，其允许灵敏、精确和有效地确定核酸序列。 所述方法通常包括通过使用单链多核巧酸扩增来扩增祀多核巧酸W产生单链多核巧酸。可 例如通过添加一个或更多个接头来处理祀核酸，并且可选择包含一个或更多个接头的核酸 并将其用于产生单链多核巧酸。可通过使用与单链多核巧酸上的目的区域杂交的探针组进 一步富集单链多核巧酸中包含目的区域的多核巧酸。 因此，在一个方面中，本申请提供了产生包含一个或更多个接头的单链多核巧酸 的方法。 在另一个方面中，提供了分析祀多核巧酸上的一个或更多个期望区域的方法。 在另一个方面中，提供了可用于本文所述方法的试剂盒、组合物和制品。 I.定义本文使用的"单链多核巧酸扩增"是指通过在包含祀多核巧酸序列的单链本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生包含不对称接头序列的单链多核苷酸的方法，其包括：i)使一个或更多个DNA片段与以下接头连接：a)包含标签的第一接头，和b)包含识别序列的第二接头；ii)基于所述标签的存在选择包含所述第一接头的DNA片段；iii)使用包含RNA的引物并使所述包含RNA的引物与所述识别序列杂交通过单链多核苷酸扩增来扩增步骤ii)中选择的DNA片段，从而选择性扩增包含所述第二接头的DNA片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：张以琳，
申请(专利权)人：以琳生物药物有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US