检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物及检测方法技术

本发明专利技术针对烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变开发了特异引物及检测方法。其特征在于，特异引物包括两条上游引物CPS2-1F和CPS2-2F以及一条公用下游引物CPS2-R。检测方法为：基于等位基因特异PCR(AS-PCR)原理，在冷杉醇合成关键基因NtCPS2的SNP突变位点处设计两条互补的上游引物，在其下游设计一条共用下游引物。以待测烟草品种的DNA为模板，使用两对特异性引物进行PCR扩增，电泳检测PCR扩增产物，判断PCR扩增产物是否含有297bp的特征条带。本发明专利技术设计的引物对具有操作简便、费用低廉、结果可靠、检测速度快，可区分杂合或纯合等优点，能够大大加快冷杉醇特异香气性状选育进程，缩短育种周期，提高育种效率。

【技术实现步骤摘要】
检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物及检测方法
本专利技术属于分子标记领域，具体涉及一种检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物及检测方法。
技术介绍
冷杉醇是一些香料烟和部分雪茄烟中重要的赖百当类物质，对烟草的香气特性起着重要作用，也是影响香味品质的类琥珀物质的重要化学前体物，此外，也有报道称冷杉醇与植物的抗虫、抗病性有关。不同类型烟草品种冷杉醇的合成存在较大差异，香料烟和大部分雪茄烟品种有冷杉醇的合成，然而大部分烤烟品种中没有冷杉醇的合成。最近的研究表明：烟草冷杉醇是以牻牛儿牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate，GGPP)为底物，由两个基因NtCPS2和NtABS编码的蛋白依次催化合成，不同烟草种质均含有NtABS基因，正是NtCPS2序列的多态性导致了不同烟草种质冷杉醇合成的差异，NtCPS2是控制冷杉醇合成的一个关键基因。研究表明，不能合成冷杉醇的烟草种质中，NtCPS2基因存在两种突变形式。一种是在NtCPS2开放阅读框中的第275位碱基位置有一个8碱基插入序列，另一种是在开放阅读框中的第292位碱基上出现了一个SNP突变，即由G转变为T。并且在不合成冷杉醇的品种中，90％以上的品种是因SNP突变引起，因此，针对NtCPS2基因的SNP突变位点开发标记引物，对利用分子标记辅助选择培育含有冷杉醇的烤烟品种，改善烤烟品种的香气品质和抗病性均具有重要意义。单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)在全基因组分布广，密度大，遗传稳定，且可实现自动化检测。因此，SNP标记是目前研究较多，有广阔前景的分子标记，其在遗传图谱构建、关联分析、分子标记辅助选择育种以及种植资源筛选等方面具有重要的意义。对于海量的SNP位点，有很多的检测方法，包括基因芯片技术、荧光能量转移法、TaqMan探针技术和焦磷酸测序技术等，虽然这些方法能够高通量分型SNP，但它们都需要专门的检测设备或复杂的技术且费用昂贵。而等位基因特异PCR(AS-PCR)弥补了上述缺陷，在简单的分子实验室仅仅需要一个电泳实验即可完成，方便快捷且具有更广泛的适用性。理论上，引物3’末端的碱基对PCR的延伸来说尤为重要，如果引物的3’末端核苷酸与SNP位点一致，DNA聚合酶就可以扩增获得特异的PGR产物，不一致则无扩增产物，这样就可以通过PCR产物的有无来检测SNP。但是，这种方法并没有广泛的应用，是因为非特异性等位基因位点3’末端错配不能够有效可靠的区分两个等位基因，只是降低了延伸效率。因此，不同改良的AS-PCR方法也相继出现并成功应用，如：引入错配碱基AS-PCR、四引物扩增受阻突变体系PCR(ARMSPCR)、片段长度差异等位基因特异性PCR(FLDAS-PCR)以及基于AS-PCR原理，采用毛细管电泳技术和荧光标记复合扩增，根据PCR片段长度差异进行分型等。这些方法的出现使开发相应的SNP标记成为可能。改善烟叶香气品质是烟草育种的重要内容之一。传统育种工作中，育种家们从分离后代中通过表型观察或昂贵的化学检测选择理想的重组基因型，这样耗时耗力且容易产生偏差。因此，分子标记辅助选择为香气品质育种开辟了一条新的途径。本研究利用引入错配碱基等位基因特异PCR，在引物3’末端不同的位置引入不同的错配碱基来改善PCR扩增效果，从而对烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的SNP位点进行分型，以期开发出用于分子标记辅助选择育种的分子标记。本专利技术旨在提供一种用于检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异性引物对及检测方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的缺陷，本专利技术提供方法简便，效率高，检测效果好的一种烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物及检测方法。利用该特异引物序列检测育种后代材料是否含有冷杉醇，不受生长条件和发育时期的影响，能够极大地加速材料的选育过程，缩短育种周期，提高育种效率。还具有成本低廉、操作简便、结果可靠、检测速度快等优点。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术公开了一种检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物，其中，所述特异引物用于检测烟草冷杉醇能否合成的特异性引物对，包括两个上游引物CPS2-1F和CPS2-2F以及下游引物CPS2-R：上游引物CPS2-1F(5’-3’)：ACAGATGAAAGGTTTGATAG上游引物CPS2-2F(5’-3’)：ACAGATGAAAGGTTTGATAT下游引物CPS2-R(5’-3’)：TCTCTTATGAAGGCACGTGT。(特异性引物对包括两条上游引物CPS2-1F和CPS2-2F以及一条公用下游引物CPS2-R)为更好的实现本专利技术目的，本专利技术又公开了检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的检测方法，包括以下步骤：S1，根据烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的第四号外显子cDNA序列，基于AS-PCR原理，在SNP突变处设计两个上游引物，使引物的3’末端核苷酸与SNP位点一致，同时在引物3’末端倒数第三位人工引入错配碱基T，在第四号外显子末端设计一个公用的下游引物，这样构成的两对引物形成互补引物，能够相互检测SNP的类型，同时也能够检测后代为杂合体或纯合体；S2，提取被检测烟草品种的DNA；S3，以被检测烟草品种的DNA为模板，使用NtCPS2基因特异性引物对被检测烟草品种的DNA进行PCR扩增；S4，采用电泳检测PCR扩增产物，判断PCR扩增产物是否含有292bp的特征条带：如果引物对CPS2-1F/CPS2-R有条带，而引物对CPS2-2F/CPS2-R无条带，则被检测烟草品种为正常纯合型G，有冷杉醇合成；反之，则被检测烟草品种为突变纯合型T，不合成冷杉醇；如果这两对引物都有扩增条带，则说明检测品种为杂合型。PCR扩增的反应体系组成为：2×DreamtaqMIX10uL，模板DNA1ul，上游引物1uL，下游引物1uL，最后用双蒸水将反应体系补至20uL。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；退火温度52℃(引物对CPS2-1F/CPS2-R)或48℃(引物对CPS2-2F/CPS2-R)30s；72℃延伸30s；共35个循环，最后72℃7min停止反应。进一步的，NtCPS2的第四号外显子序列：GTAAGCAGAACAATACAGATGAAAGGTTTGACAGAAGAGATCAAACACATGTTGAATTCGATGGAGGATGGAAGGTTAAATGTCTTAGCCTATGACACAGCTTGGGTTTCCTTTATTCCAAATACTACTAATAATGGAAATGATCAAAGACCTATGTTTCCATCTTGTCTTCAATGGATTATAGACAATCAACTTTCTGATGGTTCATGGGGAGAGGAGATTGTATTCTGCATATATGATCGACTCTTGAACACACTAGTATGTGTTATTGCATTGACATTATGGAACACGTGCCTTCATAAGAGAAACAA在上述基因序列中，前面划下划线的序列即为两个上游引物CPS2-1F和CPS2-2F；后面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物，其特征在于，所述特异引物用于检测烟草冷杉醇能否合成的特异性引物对，包括两个上游引物CPS2‑1F和CPS2‑2F以及公用下游引物CPS2‑R：上游引物CPS2‑1F(5’‑3’)：ACAGATGAAAGGTTTGATAG上游引物CPS2‑2F(5’‑3’)：ACAGATGAAAGGTTTGATAT下游引物CPS2‑R(5’‑3’)：TCTCTTATGAAGGCACGTGT。

【技术特征摘要】
1.一种检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的检测方法，包括以下步骤：S1，根据烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的第四号外显子cDNA序列，基于AS-PCR原理，在SNP突变处设计两个上游引物，使引物的3′末端核苷酸与SNP位点一致，同时在引物3′末端倒数第三位人工引入错配碱基T，在第四号外显子末端设计一个公用的下游引物，这样构成的两对引物形成互补引物，能够相互检测SNP的类型，同时也能够检测后代为杂合体或纯合体；两个上游引物CPS2-1F和CPS2-2F以及公用下游引物CPS2-R：上游引物CPS2-1F5′-3′：ACAGATGAAAGGTTTGATAG上游引物CPS2-2F5′-3′：ACAGATGAAAGGTTTGATAT下游引物CPS2-R5′-3′：TCTCTTATGAAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：常爱霞，王元英，王国平，刘旦，杨爱国，孙惠青，曹建敏，李义强，罗成刚，冯全福，刘贯山，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37