本发明专利技术涉及一种水凝胶二氧化硅光子晶体微球化学发光法高灵敏度检测伏马毒素B1的方法，该方法通过在二氧化硅光子晶体微球空隙紫外聚合凝胶，减小微球内部的多孔结构，减小非特异性生物反应的背景信号，提高检测灵敏度和准确度。以该微球表面为伏马毒素B1探针载体，在微球表面构建竞争化学发光免疫检测伏马毒素B1检测体系，利用多功能酶标仪对化学发光信号进行检测，该方法对伏马毒素B1的检测限为0.0001ng/mL，线性检测范围为0.0001到1ng/mL之间，具有检测灵敏度高、背景信号低优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设计农产品、饲料和食品中的伏马毒素高灵敏度、低背景、低成本检测技术 方法。具体通过自组装技术和紫外聚合技术合成水凝胶二氧化硅光子晶体微球，以该光子 晶体为载体，通过在该微球表面构建竞争免疫化学发光、高灵敏度、低背景、低成本检测伏 马毒素新方法。
技术介绍
伏马毒素（Fumonisin)是由镰刀菌素属（Fusarium genus)的真菌产生的代谢 物。伏马毒素污染范围广泛，在玉米及其制品中尤为明显。伏马毒素主要影响动物的肝 脏及肾脏，长期或高剂量接触会诱发肝癌，并且对胚胎、肺、肌肉骨骼等也有不同程度的损 伤，尤其是伏马毒素 BI (FBI)，能使人类和动物中毒、致癌。食品添加剂联合专家委员会 (JECFA)第56次会议确立了一组关于伏马毒素的每日最大容许摄入量（PMTDI)，规定伏马 毒素 B1 (FB1),伏马毒素 B2 (FB2)和伏马毒素 B3 (FB3)单独或者混合的每日最大容许摄入量不 超过2 μ g/kg。高灵敏度、低成本的检测技术方法是预防农产品、食品、饲料中伏马毒素污染 和食品安全评估的最有效手段之一。目前常用的伏马毒素检测方法有色谱法、免疫分析法 等。但是，色谱技术方法需要昂贵的检测设备，专门的仪器操作技术人员，检测成本高，很难 在食品安全生产、销售一线推广和普及；免疫学技术虽然简单易行，但是该技术对有些真菌 毒素检测的灵敏度不够，而且检测需要消耗大量的抗体试剂；基于多孔表面免疫方法检测 真菌毒素如光子晶体微球液相芯片化学发光方法，由于其检测背景信号高，检测限有限，准 确度较差。研究和开发一种新型的高灵敏度、低背景信号、低成本、特异性好的检测技术和 方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种农产品、饲料和食品中的伏马毒素高灵敏度、低背景、低成本检测 技术方法。具体通过自组装技术和紫外聚合技术合成水凝胶二氧化硅光子晶体微球，以该 光子晶体为载体，通过在该微球表面构建竞争免疫化学发光、高灵敏度、低背景、低成本检 测伏马毒素新方法。 本专利技术微球的制备：将制备的SiO2=维光子晶体微球用食人鱼洗液浸泡2小时， 增强其表面的亲水性，使得水凝胶液更易填满微球内部。将处理过的微球放入已配置好的 水凝胶溶液的烧杯中浸泡，并每5分钟摇晃一次，以保证SiO 2光子晶体微球与水凝胶溶液 充分接触，2小时后将烧杯中的水凝胶溶液吸走，将烧杯中放于磁力搅拌器上，加甲基硅油 没过转子，以300rpm/min的转速转动2小时，此时微球已经完全分散开。最后将分散开的 微球放于紫外灯下照射10秒钟，得到水凝胶液固定。得到的水凝胶SiO 2*子晶体微球和 SiO2光子晶体微球表面结构对照如图1。 在制备的水凝胶SiO2*子晶体微球表面修饰γ -缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷 (GPTMS)环氧基，固定伏马毒素 BI包被抗原，牛血清蛋白（BSA)封闭。在水凝胶SiO2光子 晶体微球表面构建竞争免疫化学发光、高灵敏度、低背景、低成本检测伏马毒素新方法。以 辣根过氧化物酶标记的二抗与伏马毒素 Bl抗体特异性结合，加入鲁米诺、双氧水化学发光 底物后，用多功能酶标仪检测化学发光信号值强弱。建立标准曲线和检测食品中的伏马毒 素 B1。 上述方法包括以下步骤： (1)水凝胶SiO2光子晶体微球的制备 (2)水凝胶溶液的配制方法：向烧杯中依次添加870微升的双蒸水、丙烯酸20微 升、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮10微升、聚乙二醇二丙烯酸酯100微升，用玻璃棒搅 拌充分混匀。（3)水凝胶光子晶体微球表面的修饰：通过体积比3 :7的双氧水与浓硫酸对 步骤（1)得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS) 对微球表面进行环氧基修饰； (4)抗原的固定：通过化学键合的方法将伏马毒素 Bl人工抗原（FBl-BSA)固定于 经步骤（2)表面修饰的微球表面。 (5)用水凝胶光子晶体微球对待测样品进行竞争免疫检测，利用标记有辣根过氧 化物酶的二抗与伏马毒素 Bl抗体进行特异性反应，加入化学发光底物后，用酶标仪对发光 信号强度进行检测。 谷物试样的处理： 大米、玉米和小麦使用中药粉碎机粉碎，过20目筛，称取试样各5g于IOOmL的三 角瓶中，向样品中添加不同浓度及体积的伏马毒素 Bl标准品，充分混合试样后，将其放入 通风处内，直至溶剂蒸发完全。向其中加入提取剂（甲醇：水=6 :4)15mL，在摇床内150r/ min，提取2小时，用whatman滤纸过滤，滤液即为待测样品。 竞争免疫检测： 将修饰后的微球至于离心管中，每管5球，后加入10 μ L浓度为1000ng/mL的伏 马毒素 Bl-牛血清蛋白偶联物（FBl-BSA)，4°C下过夜。后用PBST和PBS各清洗微球3次， 后向离心管中加入10 μ L含有1%牛血清蛋白（BSA)的pH = 9. 6的碳酸盐缓冲液，对微球 表面上未结合抗原的活性基团进行封闭，室温下封闭1小时，后用PBST和PBS各清洗微球 3次。向各离心管中依次加入10 μ L不同浓度梯度的伏马毒素 Bl标准溶液或提取的谷物 试样，接着再向离心管中加入IOyL的伏马毒素 Bl抗体（FBl-Ab)，37°C下竞争结合1. 5小 时，用PBST和PBS各清洗微球3次后，向离心管中加入10 μ L的稀释比率为I :6000的辣 根过氧化物酶标记的二抗（HRP-IgG)，37°C下反应1小时，用PBST和PBS各清洗微球3次。 将微球移入384黑色微孔板中，每孔加入化学发光底物液（双氧水、鲁米诺和对碘苯酚混合 物）20 μ L，用多功能酶标仪检测各孔化学发光强度，积分时间Is。伏马毒素 Bl的标准曲线 见图2。 本专利技术首先采用改进Sl6bur法合成了单分散纳米二氧化硅微球，通过二氧化硅颗 粒自组装技术，组装成结构和均一的光子晶体微球。将光子晶体微球放在蒸馏水中用超声 波洗净后将其浸入食人鱼洗液（浓硫酸：双氧水=7 :3)进行清洗，使其表面硅羟基增多， 将处理过的微球放入已配置好的水凝胶溶液的烧杯中浸泡，并每5分钟摇晃一次，以保证 SiO2光子晶体微球与水凝胶溶液充分接触，2小时后将烧杯中的水凝胶溶液吸走，将烧杯中 放于磁力搅拌器上，加甲基硅油没过转子，以300rpm/min的转速转动2小时，此时微球已经 完全分散开。最后将分散开的微球放于紫外灯下照射10秒钟，得到水凝胶液固定。利用 1%的γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS)甲苯溶液浸泡，使其表面修饰环氧基。通 过优化包被pH值及化学发光底物反应时间，伏马毒素 Bl抗原浓度，伏马毒素 Bl抗体及辣 根过氧化物酶标记的二抗稀释比率，确定了最佳包被pH值为9. 6,包被浓度为1000ng/mL， 抗体稀释比率分别为I :30000和I :6000，化学发光底物反应时间为5min。 利用水凝胶光子晶体微球具有较大的表面积，内部孔结构填充水凝胶的特点，不 但能有效固定大量的靶分子探针，而且能够避免非特异吸附造成的背景信号高的特点。该 技术建立的方法检测标准曲线和同粒径下SiO 2光子晶体微球、玻璃微球标准曲线比较见图 3,很明显，SiO2光子晶体微球具有很高的检测背景信号，表现在该FBl标准曲线下IC 5。值本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用水凝胶二氧化硅光子晶体微球化学发光法检测伏马毒素B1的方法，其特征在于，通过在二氧化硅光子晶体微球空隙紫外光照射下聚合凝胶，减小微球内部的多孔结构；以该水凝胶二氧化硅光子晶体微球表面为伏马毒素B1探针载体，在微球表面构建竞争化学发光免疫检测伏马毒素B1检测体系，利用多功能酶标仪对化学发光信号进行检测；包括以下步骤：(1)水凝胶二氧化硅光子晶体微球的制备；(2)水凝胶二氧化硅光子晶体微球的修饰：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤(1)得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ‑缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷对微球表面进行环氧基修饰；(3)抗原的固定：通过化学键合方法将伏马毒素B1人工抗原固定于经过步骤(2)修饰的微球表面；(4)用水凝胶二氧化硅光子晶体微球对待测样品进行竞争免疫检测；利用多功能酶标仪检测化学发光信号值。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李建林，徐杰，李玮，杨浥，徐婧婧，沈鹏，刘蕊，郑铁松，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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