一种检测农药三唑锡的电化学免疫传感器及其制备方法与应用，所述电化学免疫传感器包括工作电极、参比电极、辅助电极，所述工作电极由基底电极表面依次固定萘酚膜，纳米四氧化三钴/聚苯胺复合膜，戊二醛，三唑锡人工抗原，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。本发明专利技术还包括所述电化学免疫传感器的制备方法。本发明专利技术之检测大位阻农药三唑锡的Co3O4电化学免疫传感器具有原料易获得，稳定、标记牢固、不干扰抗原抗体反应、样品处理简单、检测速度快、携带便捷等优点，并且保质期长，贮存条件容易达到，适合于现场检测，同时检测多种药物。
【技术实现步骤摘要】
一种检测农药三唑锡的电化学免疫传感器及其制备方法
本专利技术涉及一种检测农药残留的电化学免疫传感器及其制备方法，具体涉及一种检测大位阻农药三唑锡的电化学免疫传感器及其制备方法。
技术介绍
三唑锡(ACT)又称倍而霸、灭螨锡、亚环锡等，化学名称为1-(三环己基甲锡烷基)-1-氢-1,2,4-三氮杂茂，分子式为C20H35N3Sn，CAS号为41083-11-8，为触杀作用较强的广谱性杀螨剂，可杀灭若螨、成螨和夏卵，残效期较长。我国国家标准GB16333-1996规定三唑锡在水果中的最高残留限量为2.0mg/kg，而国际食品法典委员会(CAC)规定三唑锡的最高残留限量为0.1mg/kg，法国规定三唑锡的最高残留限量为0.20mg/kg。目前，农药残留检测方法主要有仪器检测法、免疫检测法等。其中，仪器检测法主要包括气相色谱法、液相色谱法、质谱法、气质联用法及液质联用法等，但通常需要对样品进行繁琐复杂的预处理，耗时费力，成本高，而且所用仪器比较昂贵，一次性投入较大，需要专业技术人员维护，不适于现场检测。酶联免疫吸附测定法(ELISA)现在已成为目前分析化学领域中的前沿技术，可以开发出许多快速检测产品，例如快速检测试剂盒、快速检测试纸条，免疫传感器等；试剂盒或试纸条产品一般是针对一个药物，即单残留的检测，但实际生产中由于农药的复配使用非常普遍，农产品中残留的农药往往有多种，单农药组分免疫分析方法难以满足实际检测的需要，但对于不同类的多种抗体就很难在一个试剂盒或试纸条上实现同时检测，一种简单且有效的改进措施就是使用生物传感器。目前商品化的农药传感器主要基于AChE的抑制作用来检测农药，但AchE电流型生物传感器的最大缺点是酶催化产物硫代胆碱的氧化反应需要较高的电位，会大大降低传感器的稳定性；同时使用媒介质，酶抑制作用的生物传感器的选择性差，为了提高生物传感器的选择性，人们研制了以抗体作为识别受体的免疫传感器，同时将纳米材料引入分析化学研究中，成为一个研究热点，已取得许多创新性研究成果。近年来，免疫传感器作为一种新兴的生物传感器以其鉴定物质的高度特异性、敏感性和稳定性，在国民经济中的临床诊断、工业控制、食品和药物分析、环境保护以及生物技术、生物芯片等研究中有着广泛的应用前景。目前，国内尚无三唑锡快速检测试剂盒和免疫传感器等快速检测的产品。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种检测农药三唑锡的电化学免疫传感器。本专利技术进一步所要解决的技术问题是，提供一种检测农药三唑锡的电化学免疫传感器的制备方法。本专利技术进一步所要解决的技术问题是，提供一种利用检测农药三唑锡的电化学免疫传感器检测三唑锡的方法。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是，一种检测农药三唑锡的电化学免疫传感器，包括工作电极、参比电极、辅助电极，所述工作电极由基底电极表面依次固定萘酚膜，纳米四氧化三钴/聚苯胺复合膜(nano-Co3O4/PAN)，戊二醛，三唑锡人工抗原，并以牛血清蛋白(BSA)封闭非特异性活性位点。进一步，所述基底电极为ITO玻璃电极,所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述辅助电极为铂电极；所述三唑锡人工抗原是以三环锡和5-巯基-3-氨基-1,2,4-三氮唑为初始原料先合成三唑锡半抗原，再与牛血清蛋白偶联制备而成的三唑锡人工免疫抗原。本专利技术进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种检测农药三唑锡的电化学免疫传感器的制备方法，首先在预处理的基底电极表面滴加萘酚溶液，烘干；接着滴加纳米四氧化三钴/聚苯胺复合材料，烘干；再分别滴加戊二醛溶液活化，清洗，氮气吹干；然后滴加三唑锡人工抗原，孵育，过夜，清洗，烘干,最后滴加牛血清蛋白缓冲液封闭。进一步，所述农药三唑锡的电化学免疫传感器制备方法包括以下步骤：(1)纳米四氧化三钴/聚苯胺复合材料的制备：将0.3～0.4g十六烷基三甲基溴化铵溶解在45～55mL蒸馏水中，加入0.2～0.4g的四氧化三钴纳米颗粒，超声分散、搅拌4.5～5.5h后加入150～200μL苯胺，持续搅拌0.5～1.5h，加入相当于苯胺物质的量1.5倍的柠檬酸，搅拌9.5～10.5h，加入与苯胺物质的量等量的硫酸铵，继续搅拌11.5～12.5h后停止反应，将反应后的产物进行抽滤，保留滤饼，依次用去离子水和无水乙醇多次洗涤至滤液无色，将滤饼置于真空烘箱中60℃干燥4小时即得nano-Co3O4/PAN复合材料，备用；(2)三唑锡人工抗原的合成：称取193g～195g的三环锡用24～26mL甲醇将其溶解，然后缓慢的滴加到58g～59g用48～52mL80℃～85℃热水溶解的5-巯基-3-氨基-1,2,4-三氮唑(5-巯基-3-氨基-1,2,4-三氮唑因其在冷水和甲醇中均不溶解，而在热水中溶解性很高故此反应选用高温反应)，搅拌1～2h后有大量白色沉淀生成，将白色沉淀过滤后用开水洗涤3～4遍，干燥后用95％乙醇进行重结晶，即得三唑锡半抗原ACT-H1；将8mg～10mg三唑锡半抗原用2.5mL～3.5mLDMF溶解，涡旋震荡下缓慢的加入9mL～11mL蒸馏水，然后加入38mg～42mgBSA，待完全溶解后，滴加30～50μL戊二醛溶液，4℃下搅拌过夜，溶液由乳白色变为微黄色；4℃下用生理盐水溶液透析45h～48h，每3～4h换一次水；即得到三唑锡免疫抗原ACT-H1-BSA，用生理盐水稀释至1mg/mL～1.5mg/mL，-20℃保存；(3)基底电极的预处理：将基底电极切成4×1cm，乙醇超声清洗，烘干，用绝缘胶将探头面积封至1cm2，再依次用洗洁精、丙酮、乙醇、去离子水中各超声清洗5～10min，氮气吹干，备用；(4)基底电极的表面修饰：首先在步骤(3)备用的基底电极表面滴加50～60μL0.75％萘酚溶液，烘干；接着滴加100～120μL1:400稀释的步骤(1)中备用的纳米钴-四氧化三钴/聚苯胺复合材料，烘干；再接着滴加100～120μL0.25％戊二醛溶液，常温下活化2～3h后，用水冲洗干净并用氮气吹干，然后滴加100～120μL1:1600稀释的三唑锡人工抗原，于37℃下孵育3～4h，过夜，用0.01mol/L,pH7.2～7.6的PBS缓冲液冲洗干净，烘干；(5)非特异性活性位点的封闭：将表面修饰后的基底电极滴加100～120μL5mg/mL牛血清蛋白缓冲液放于37℃恒温封闭5～6h，取出用0.01mol/L,pH7.2～7.6的PBS缓冲液冲洗干净，即得电化学免疫传感器。本专利技术进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种利用检测农药三唑锡的电化学免疫传感器检测三唑锡的方法，包括以下步骤：(1)修饰工作电极：先将电化学免疫传感器的工作电极滴加三唑锡单克隆抗体溶液和三唑锡标准品组成的混合液；放于37℃下孵育50～70min，取出用0.008～0.012mol.L-1pH7.2～7.6的PBS缓冲液反复冲洗干净，随后滴加纳米银标记的IgG-HRP抗体，37℃下孵育30～45min，取出用0.008～0.012mol.L-1pH7.2～7.6的PBS缓冲液反复冲洗干净，备用；(2)建立工作曲线：将步骤(1)中修饰后的工作电极与参比电极、辅助电极插入体积比为1∶1∶1，物质的量之比满足0.1∶5∶5的氯化钾、亚铁氰化钾和铁氰化钾本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测农药三唑锡的电化学免疫传感器，其特征在于，包括工作电极、参比电极、辅助电极，所述工作电极由基底电极表面依次固定萘酚膜，纳米四氧化三钴/聚苯胺复合膜，戊二醛，三唑锡人工抗原，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点。
【技术特征摘要】
1.一种检测农药三唑锡的电化学免疫传感器，其特征在于，包括工作电极、参比电极、辅助电极，所述工作电极由基底电极表面依次固定萘酚膜，纳米四氧化三钴/聚苯胺复合膜，戊二醛，三唑锡人工抗原，并以牛血清蛋白封闭非特异性活性位点，所述基底电极为ITO玻璃电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述辅助电极为铂电极；所述三唑锡人工抗原是以三环锡和5-巯基-3-氨基-1，2，4-三氮唑为初始原料先合成三唑锡半抗原，再与牛血清蛋白偶联制备而成的三唑锡人工抗原。2.一种如权利要求1所述的检测农药三唑锡的电化学免疫传感器的制备方法，首先在预处理的基底电极表面滴加萘酚溶液，烘干；接着滴加纳米四氧化三钴/聚苯胺复合材料，烘干；再滴加戊二醛溶液活化，清洗，氮气吹干；然后滴加三唑锡人工抗原，孵育，过夜，清洗，烘干，滴加牛血清蛋白缓冲液封闭。3.根据权利要求2所述的检测农药三唑锡的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)纳米四氧化三钴/聚苯胺复合材料的制备：将0.3～0.4g十六烷基三甲基溴化铵溶解在45～55mL蒸馏水中，加入0.2～0.4g的四氧化三钴纳米颗粒，超声分散、搅拌4.5～5.5h后加入150～200μL苯胺，持续搅拌0.5～1.5h，加入相当于苯胺物质的量1.5倍的柠檬酸，搅拌9.5～10.5h，加入与苯胺物质的量等量的硫酸铵，继续搅拌11.5～12.5h后停止反应，将反应后的产物进行抽滤，保留滤饼，依次用去离子水和无水乙醇多次洗涤至滤液无色，将滤饼置于真空烘箱中60℃干燥4小时即得纳米四氧化三钴/聚苯胺复合材料，备用；(2)三唑锡人工抗原的合成：称取193g～195g的三环锡用24～26mL甲醇将其溶解，然后缓慢的滴加到58g～59g用48～52mL80℃～85℃热水溶解的5-巯基-3-氨基-1，2，4-三氮唑中，搅拌1～2h后有大量白色沉淀生成，将白色沉淀过滤后用开水洗涤3～4遍，干燥后用95％乙醇进行重结晶，即得三唑锡半抗原ACT-H1；将8mg～10mg三唑锡半抗原用2.5mL～3.5mLDMF溶解，涡旋震荡下缓慢的加入9mL～11mL蒸馏水，然后加入38mg～42mgBSA，待完全溶解后，滴加30～50μL戊二醛溶液，4℃下搅拌过夜，溶液由乳白色变为微黄色；4℃下用生理盐水溶液透析45h～48h，每3～4h换一次液；即得到三唑锡人工抗原ACT-H1-BSA，用生理盐水稀...
【专利技术属性】
技术研发人员：王伟华，韩占江，梁鹏举，向延菊，田木星，宋周林，马政彪，李春艳，赵海蓉，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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