一种用于诊断肝癌的联合型代谢标志物及其检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及血清样品中小分子代谢物色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸作为联合标志物在制备用于诊断受试者中的肝癌患者的试剂盒中的新应用。本发明专利技术还涉及检测受试者中的肝癌患者的试剂盒，通过检测来自受试者的血清样品中上述联合标志物各自的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量P，再基于确定的截点值，判断所述受试者是否患有肝癌。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明专利技术涉及的几种小分子代谢物，且具有检测成本低，重复性好的特点。本发明专利技术可应用于辅助肝细胞癌的临床诊断，具有诊断灵敏度高，可早期判别肝癌以及与传统的临床诊断标志物甲胎蛋白相互补充的特点，具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于诊断肝癌的联合型代谢标志物及其检测试剂盒
本专利技术涉及分析化学，生物化学以及临床医学领域。
技术介绍
肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，致死率高。中国是世界上肝癌发病率最高的地区之一，大部分肝癌病人主要由肝硬化发展形成。肝癌早期症状不明显，具有进展迅速、易早期转移的特点，在临床上早诊困难、预后效果差。当前，B型超声显像、肿瘤标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)的血清含量检查是肝癌筛查的主要方法。然而，B超在小肝癌和肝硬化结节的鉴别上常有困难。甲胎蛋白(AFP)血清水平在诊断肝癌时存在敏感性和特异性较低的缺点，单独用于确诊时的检出率一般只有50％—75％左右。以上方法的局限性极大地限制了肝细胞癌的早期有效诊断，预警作用有限。对于肝细胞癌的早期有效诊断有助于显著提高患者的生存率，因此，开发具有临床早诊潜力的新方法对于降低肝细胞癌的发病率和死亡率具有非常重要的现实意义。近年来，代谢组学技术作为一个新的有力工具，被广泛运用于疾病研究中。色谱质谱联用技术是代谢组学的主要研究手段，其检测小分子代谢物在疾病诊断中的应用已有成功的案例，包括基于检测多种氨基酸的新生儿疾病筛查、检测肌氨酸的前列腺癌判别等。由于单一代谢物所受影响因素较多，因此从血清代谢谱中优选出由少数代谢物构成的“联合型的代谢标志物”，并以判别公式计算“判别可能性”P值(Probability)，能够显著改善代谢物对疾病诊断的灵敏度以及特异性。考虑到体内极性代谢物在肿瘤生成及抑制方面的关键调控作用，本专利技术采用基于毛细管电泳-质谱联用的代谢组学技术和研究方法，检测血清中的极性代谢物，经过生物信息学分析，筛选目标代谢物，旨在肝细胞癌的诊断中进行应用。本专利技术从利用毛细管电泳-飞行时间质谱联用获取的肝癌患者，肝硬化患者以及正常人的血清代谢谱中，经多次优选，确定了基于色氨酸、谷氨酰胺及2-羟基丁酸的联合使用，以作为一种联合型的代谢标志物在判断肝癌中的新用途。该组代谢物分别是体内参与生理过程的重要代谢物。色氨酸参与调控肿瘤的免疫抑制，谷氨酰胺参与肿瘤能量代谢及合成过程，而2-羟基丁酸与氧化应激密切相关，目前尚无将该三种代谢物联合用于肝癌诊断的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对肝细胞癌早期诊断困难尤其是与肝硬化患者难以区分的临床实际问题，提供了一种基于新的小分子极性代谢物的组合对肝癌患者有效判断的新用途，并提供用于上述小分子代谢物的检测方法。该代谢物联合标志物包括下列三种代谢物：色氨酸、谷氨酰胺以及2-羟基丁酸。其中，色氨酸在质谱正离子模式下检测到的质核比为205.0972，谷氨酰胺正离子模式下的质核比147.0764；2-羟基丁酸在质谱负离子模式下检测到的质核比为103.0401。上述三种物质的检测试剂盒如下：标准品：包括色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸，所述标准品分别用于对应的血清代谢物色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸的定性；用于预处理来自受试者的血清样品的提取液：包含内标物5-10μM的蛋氨酸砜，5-10μM的D-樟脑-10-磺酸钠盐或稳定同位素标记的色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸，及其它稳定同位素标记的内源性小分子代谢物的甲醇溶液；用于毛细管电泳-质谱分离的缓冲液，包括1M甲酸(正离子模式下采用)，50mM的乙酸铵(PH值以氨水调节至8.5，负离子模式下采用)。计算受试者血清样品中的联合标志物变量P的方法如下：1)受试者样本处理：以血清样品的提取液处理来自受试者的血清样本，然后进一步提取极性代谢物。2)以毛细管电泳-质谱对经步骤1)处理的血清样本进行分离，并由质谱检测。3)经毛细管电泳-质谱分析后，所得电泳峰强度与分别与内标物比较，正离子与蛋氨酸砜(或同位素内标)，负离子与D-樟脑-10-磺酸钠盐(或同位素内标)相比较，获得上述三种物质的相对浓度。4)进一步将色氨酸、谷氨酰胺及2-羟基丁酸回归为联合标志物变量P，二元逻辑回归方程如下：P＝1/(1+e-(14.315+0.776a-13.437b-0.829c))其中，a为血清中2-羟基丁酸的相对含量，b为血清中色氨酸的相对含量，c为血清中谷氨酰胺的相对含量。所得变量P在肝细胞癌患者中增高，该变量值可用于辅助判断肝细胞癌。本专利技术确定的该联合标志物的对肝癌判断的最佳截点值(cut-off值)设为0.424，高于该截点值的则可能为肝细胞癌。也可以根据实验者的实际结果通过二元逻辑回归得到新的方程，并定义该实验室的最佳截点值。截点值的确定依据为根据联合标志物变量P值作受试者工作特征曲线(ROC曲线)，取灵敏度与特异性之和最大的P值作为最佳截点值。该联合型代谢标志物用途：将肝细胞癌与肝硬化患者及正常人进行有效区分，适用于肿瘤直径小于3cm的小肝癌患者与肝硬化患者的区分，以及AFP阴性(<20ng/mL)肝癌患者与肝硬化患者的区分。本专利技术原理如下：(1)利用毛细管电泳-飞行时间质谱联用的代谢组学分析技术，对正常人、肝硬化患者、肝细胞癌患者的血清样本进行代谢轮廓分析，获得代谢物定性定量分析结果。(2)基于多种生物信息学数据处理方式结合的策略，进行标志物的发现。具体实施方式为：a)多变量分析：建立三组样本的偏最小二乘判别分析模型，代谢物挑选条件：在第一、二主成分上的重要性因子(VIP)值同时大于1；重要性因子的置信区间为正；在第一或第二主成分上的协方差(p(corr))绝对值大于0.3。b)单变量分析：采用非参数检验法，挑选满足肝癌组与正常对照组、肝癌组与硬化组同时具有显著性差异(p<0.05)的代谢物。c)以上两种分析方法获得交集代谢物，在z值图中观察他们在三组样本中含量分布，并验证含量的置信区间。排除z值分布过大，含量置信区间为负的代谢物。d)假阳性率(FDR)评价，只保留FDR值小于1.5％的代谢物。e)相关性分析，筛选与临床肿瘤标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)的血清含量相关性小的代谢物，作为获选标志物。(3)应用另一批正常人、肝硬化和肝癌患者(含小肝癌)血清样本对以上筛选出的候选物进行验证。同时结合ForwardStepwise(Wald)方法，优选出色氨酸、谷氨酰胺和2-羟基丁酸这一联合标志物组合。本专利技术具有如下效果：血清中的色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸构成的联合标志物其衍生的联合标志物变量P，能够对肝细胞癌诊断很好的识别，并与AFP具有较好的互补性。本专利技术涉及的检测试剂盒，对上述代谢物组合的检测，具有简便，快速重复性好的优点，适于肝癌的早期筛查和以及对传统标志物及临床诊断方法的辅助应用。附图说明图1.色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸在发现集与验证集各组样本中的含量变化(均值±标准偏差表示)。*表示与正常对照组具有显著性差异，#表示与肝硬化组具有显著性差异，&表示小肝癌与一般肝癌组具有显著性差异。*(或#，&):0.01<p<0.05，**(##):0.001<p<0.01，***(###):p<0.001。图2.(A)实例1(发现集)中联合标志物用于诊断肝细胞癌与非癌(正常人与肝硬化)的ROC曲线图。(B)实例2(验证集)中联合标志物用于诊断所有本文档来自技高网...

【技术保护点】
联合型的代谢标志物在制备用于诊断受试者中的肝癌患者的试剂盒的用途，所述联合标志物由色氨酸、谷氨酰胺、2‑羟基丁酸共同构成。

【技术特征摘要】
1.联合型的代谢标志物在制备用于血清诊断受试者中的肝细胞癌患者的试剂盒的用途，所述联合型的代谢标志物由色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸共同构成。2、一种非诊断目的的计算受试者的血清样本中的联合型标志物变量的方法，其中所述受试者包括肝细胞癌患者，及对照的肝硬化患者和/或正常人，所述联合型标志物由色氨酸、谷氨酰胺、2-羟基丁酸共同构成，所述方法包括以下步骤：1）以含有内标物的提取液处理来自受试者的血清样本，沉淀血清蛋白后，进一步提取极性代谢物，随后进行超滤、冻干，以纯水复溶后进行毛细管电泳-质谱分析；2）在毛细管电泳-质谱分析获得的总离子流图上，提取色氨酸、谷氨酰胺及2-羟基丁酸的电泳峰强度，色氨酸的提取参数为:正离子模式，质荷比为20...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，曾珺，尹沛源，孔宏伟，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21