本发明专利技术涉及一种重组基因VII型新城疫多表位疫苗的制备与应用。所述疫苗以基因VII型新城疫病毒主要囊膜糖蛋白：融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)及核衣壳蛋白(NP)Th表位、CTL表位以及B细胞表位作为疫苗框架结构，通过柔性linker连接，克隆入pRSETA载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的新城疫多表位疫苗。动物实验表明，重组基因VII型新城疫多表位疫苗不仅安全性良好，而且能够激发有效的体液免疫与细胞免疫反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种重组基因VII型新城疫多表位 疫苗制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将与新城疫病毒感染有关的两个主要囊膜糖 蛋白：融合蛋白（F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN)及核衣壳蛋白（NP)的B细胞表位、Th 表位以及CTL表位串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、乳化工艺制备，得到 重组新城疫多表位疫苗以及该疫苗在预防新城疫中的应用。
技术介绍
NDV属于副粘病毒科，副粘病毒属病毒，是由NDV(NewcastleDiseaseVirus)引起 的侵害禽类的一种高度接触性、急性、烈性传染病，是威胁世界养禽业的主要疾病之一，被 国际兽疫局（OIE)列为A类传染病，可感染大多数禽类。我国于1948年首次分离到NDV，至 今ND在我国全国范围内发病仍然比较普遍，制约着我国养禽业的发展及禽产品的出口，也 对食品安全及人类健康存在潜在的危害。尽管新城疫免疫接种已经普及多年并己基本上控 制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍时有发生。 基因VII型NDV自20世纪80年代早期就已经在东亚流行（Aldous.etal.，2003)。 1995年，我国台湾地区暴发了严重的ND大流行，Yang等证实了基因VII型NDV是造成台湾 1995年至今ND流行的主要病原。严维巍等首次报道了基因VII型在大陆的存在。LiuXF 等对1985-2001年中国部分地区鸡群和鹅群中分离到的新城疫毒株基因型分析发现，29株 NDV中有14株属于基因VII型；Qin等从我国1996-2005年全国各个地区鸡，鸭、鹅体内分 离到30株NDV，其中17株属于基因Vll型；LiuHL等对2005年NDV分离株分析发现，基 因VII型毒株占分离总数的77%;Zhangrui等根据我国2001-2009年分离到的17株NDV 发现基因VII型NDV所占的比重呈逐年上升的趋势。随着时间的推移，基因VII型分离株 逐渐变为优势毒株。 新城疫病毒是有囊膜的单股负链RNA病毒，基因组为15kb，编码至少六种蛋白，顺 序为3' -NP-P-M-F-HN-L-5'，分别为核衣壳蛋白（NP蛋白）、磷蛋白（P蛋白）、基质蛋白（M 蛋白）、融合蛋白（(F蛋白）、血凝素-神经氨酸酶（HN蛋白）、大分子蛋白（(L蛋白）。NDV 中有两个主要的成分-融合蛋白（F)和血凝素一神经氨酸酶（HN)都与病毒感染有关。HN 介导病毒与宿主细胞受体的结合，使病毒吸附到细胞膜上；F介导病毒囊膜与宿主细胞浆 膜的融合，促进病毒的穿入，还可以促进病毒在细胞间的感染。F和HN均是病毒囊膜上的糖 蛋白，均能产生中和抗体，都是重组疫苗的候补对象。研究人员发现将NDVF和HN基因插 入FPV中构建重组病毒，FPV-NDV-F和FPV-NDV-HN均可提供对发病和死亡的保护。Iritani 等（1991)证明常规NDV疫苗和重组FPV-NDV结合使用比单独使用免疫效果好，Taylor等 (1996)构建了表达NDVF和HN基因的重组禽痘病毒，无论将其用于SPF鸡还是商品鸡都能 有效的保护鸡抵抗强毒的攻击。 F蛋白是NDV中功能最多的蛋白之一，位于病毒的囊膜上，由1792bp组成，成熟 的F蛋白由553个氨基酸残基组成，主要负责病毒囊膜与细胞膜的融合，是病毒感染细胞 所必须的重要成分。在病毒的长期进化过程中，F蛋白的结构和功能保持着高度的稳定性，Toyoda等对多株NDV的F蛋白的氨基酸序列进行了比较，结果表明相互之间保守程度很高， 同源性可达到89. 3%~99. 6%。其与病毒的感染作用密切相关，对病毒的毒力发挥决定作 用，但不是唯一的决定因子。F蛋白含有三个已知的抗原表位，分别在161、72、343氨基酸 残基处，Leu-343位于Fl亚基C末端，这个部位高度保守并且含有大量的半胱氨酸，该表位 在病毒的抗原性以及结构和功能上起重要作用。Fl和F2的裂解位点之间有一个半胱氨酸 残基，有利于位于F2亲水区的位点Asp-72同FlN末端接近，形成与抑制融合相关的抗原表 位。位点Thr-161位于FlN端，与前两个位点相比，该区的亲水性较低，被认为是病毒的融 合体，它使病毒与细胞之间通过疏水作用而融合大多数毒株F蛋白氨基酸的变异集中在信 号肽区（1~32aa)，因此，它不是F蛋白功能区的组成成分。最重要的差异存在于F蛋白的 裂解区域（112_117aa)，其氨基酸序列及裂解能力是决定病毒毒力的关键，FO蛋白对蛋白 水解酶的敏感性与其毒力强弱呈正相关。HN蛋白是NDV除F蛋白之外另一种较大表面的糖蛋白，HN蛋白是一种纤突状糖蛋 白，具有多种生物学功能，同时具有血凝素和神经氨酸酶活性。成熟的HN是一种四聚体寡 聚蛋白。亚单位之间通过二硫键相连形成二聚体，两个二聚体非共价结合形成四聚体。HN 蛋白是以氨基酸作为跨膜区的，不同NDV毒株HN蛋白的氨基酸序列差异主要集中在氨基 端。HN蛋白的胞外区可以分为两个区域：一是靠近囊膜的柄状区，另一为末端球状区。球 状区上面分布了受体结合位点和神经氨酸酶活性位点，但对柄状区的几个保守氨基酸进行 突变，也会影响这种生物学功能。Stone-Huslande等研究表明，HN蛋白的促进融合功能与 HN和F蛋白间七肽重复序列的互动有关。NP蛋白基因长度为1746bp，共编码489个氨基酸，分子量为56kD。NP蛋白是保守 性相对较高的一个，NP基因在基因组中的位置正好是靠近病毒基因组RNA的位置，其与病 毒的复制繁殖密切相关（Peetersetal. 2000!Phillipsetal. 1998)。NP上分布了三类 活性位点，即P蛋白结合位点、NP-NP相互结合位点和与RNA结合的位点。NP蛋白可能是病 毒转录与复制的切换因子，感染细胞内游离NP的浓度是控制病毒RNA转录和复制的主要因 素。NDV基因组的3'端和5'端均有一段RNA序列作为衣壳化信号。P蛋白通过和NP蛋白 之间的相互作用，抑制NP对不含引导序列RNA的结合，这种作用还提供了可溶性的Np蛋白 来对新合成的RNA衣壳化。在NDV的多个蛋白中，随着分子生物学技术的不断发展，NP基因 的研究价值越来越受到众多学者的重视。Kho等用体外蛋白结合试验证明P蛋白发生结合 的位点位于NP蛋白N端的前25个氨基酸区域，并且NP-P蛋白在此区域的结合是相当牢固 的。Ahmad-Raus等用一组单抗分析了NP蛋白上的抗原位点，结果发现，NP蛋白上存在3个 抗原位点，一个位于NP蛋白C端441-489位氨基酸，另外两个在N端26-121位和122-375 位氨基酸之间。王同燕（2009)运用反向遗传技术构建重组病毒的试验表明，决定NDV毒力 的区域主要位于NP基因的编码区，并且是NP基因的保守区位置。 活疫苗一般由感染胚尿囊液冻干而成，它可以大规模饮水免疫，经济实惠，也可用 于喷雾和气雾，在短时间内免疫大量鸡。Bl株和LaSota株是天然弱毒株，几乎无致病性，可 作为缓发型疫苗，经滴鼻，点眼，饮水，气雾等途径接种免疫，能达到较好的保护效果。而H 株、Roakin株等属中发型的疫苗，由于毒力较强，只能用于二次免疫。也有用CS2株、V4株 等作活疫苗的，也能达到良本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因VII型新城疫多表位疫苗融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：齐春梅，李殿明，蒲勤，张毓金，田春辉，刘甜甜，任百亮，张导春，党将将，吴启凡，张晓丹，
申请(专利权)人：青岛红桥明勤生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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