一株高产厚垣孢子的绿色木霉及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株高产厚垣孢子的绿色木霉及其应用。该菌株为绿色木霉(Trichoderma viride)菌株TW12，保藏编号为CGMCC No.11048。发明专利技术还提供了一种含有所述绿色木霉菌株TW12的生物防治制剂及其制备方法。实验表明，本发明专利技术的绿色木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、厚垣孢子产生率大，抗逆性强，在黄瓜、柑橘叶片能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该绿色木霉菌株TW12制备的生物防治制剂，可以作为防治黄瓜病害的生物农药或生物肥料，防治多种黄瓜灰霉病、黄瓜菌核病和柑橘炭疽病等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物防治植物病害领域。具体而言，本专利技术涉及一种高产厚垣孢子的 绿色木霉菌株及其应用。
技术介绍
木霉（Trichoderma spp.)，属于半知菌类的丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，是一类 广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶及各种发酵物上的真菌，从植物根圈、叶片及种子、球茎表 面均可以分离到。木霉通过产生抗生素、营养竞争、重寄生、细胞壁降解酶以及诱导植物产 生抗性等机制，对于多种植物病原菌具有拮抗作用，可抑制多种植物病害，是目前生防菌株 中研究最为广泛的菌株之一。木霉对植物病原菌的生物防治机制是多样而复杂的，常常是 多种机制共同作用的结果，不同的菌株生防机制的侧重点不同，其生防作用效果与菌株类 型、病原真菌的类型、作物类型和环境条件密切相关。但由于木霉菌孢子不具备抗逆性，在 高温、干燥和强光下就会死亡，失去抑菌活性。实验表明，一般不经过特殊处理的木霉菌孢 子，在常温下（25°C )，相对湿度80%，存活时间只有12天，添加保水剂和紫外线防护剂，其 存活时间只有2个月。因此，获得具有产生抗逆性很强的厚垣孢子产生菌就具有特殊意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高产厚垣孢子的绿色木霉菌株TW12,该菌株不仅能够 产生抗逆性很高的厚垣孢子，而且对黄瓜灰霉病、菌核病和柑橘炭疽病都具有很高防治效 果。本专利技术的绿色木霉菌株不仅生长速度快、产孢量大、作用谱广，而且厚垣孢子生成率超 过45%，大大增加了抗逆性，储存时间长，且具有在黄瓜叶片、柑橘叶片能够快速大量定殖 等特点，因此具有良好的应用前景。 本专利技术所提供的菌株为绿色木霉（Trichoderma viride)菌株TW12,是从潍坊北 部渤海滩涂潮间带的枯木上分离获得的，已于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No. 11048。其具有以下生物学特性：在PDA琼脂 培养基上生长快，32°C黑暗条件下培养2d，菌落直径75mm。菌落初期白色稀疏，后期形成黄 绿色产孢区，3d即形成大量绿色孢子。反面无色。菌丝聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式 的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4. 5-10X2. 5-3. 5 μπι。分生孢 子椭球形、单个，近无色，聚集时呈淡绿色，壁稍粗糙，3. 5-5 X 3-4 μ m。 本专利技术绿色木霉菌株TWl2的培养方法或繁殖方法包括： (1)普通培养保存采用PDA培养基，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸 馏水 1000 mL ; (2)实验室液体培养采用PDB培养基，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水 1000 mL ； (3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，所述固料和无机盐溶液的质量比为1 : I. 8 ;所述固料由质量比为60 :10 :30的木粉、玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述 无机盐溶液的组分及含量为：3. 5%磷酸二氢钾，0. 05%硫酸镁，0. 5%硫酸钙，4%硫酸铵， 0. 05%氯霉素，1. 3%轻质碳酸|丐，剩余为水。 (4)大量发酵培养基配方：同（3)中固体培养基配方。 本专利技术还提供了一种含有所述绿色木霉菌株TW12的生物防治制剂。 本专利技术所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤： (1)制备所述绿色木霉菌株TW12的种子液； (2)将步骤（1)制备的种子液接种到固体培养基中，28_30°C下恒温培养3~5d ; (3)将步骤（2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养 基，在室温28-30°C、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。 其中，步骤（2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶 液的质量比为I :1. 8 ;所述固料由质量比为60 :10 :30的木粉、玉米粉和麸皮组成；按质量 百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3. 5%磷酸二氢钾，0. 05%硫酸镁，0. 5%硫酸 钙，4 %硫酸铵，0. 05 %氯霉素，1. 3 %轻质碳酸钙，剩余为水。 并且，步骤（3)中的大量发酵培养基同固体培养基。 在本专利技术的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤： (1)将所述绿色木霉菌株TW12的孢子移植到PDB液体培养基中，28-30°C摇床振荡 培养2~3d得到种子液；PDB液体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000 mL ; (2)将步骤（1)制备的种子液按质量比15%的比例接种到固体培养基中，28_30°C 下振荡培养3~5d，期间维持相对湿度85%以上； (3)将步骤⑵培养的培养物加入无菌水按质量比1 :15的比例混合，过滤，将滤 液按体积比1 :6的比例接种至大量发酵培养基，室温28-30°C、相对湿度85%以上的发酵室 中发酵培养8~9d。 本专利技术还提供了上述绿色木霉菌株TW12或者上述生物防治制剂在防治黄瓜灰霉 病、黄瓜菌核病和柑橘炭疽病中的用途。 并且，本专利技术还提供了一种用于防治黄瓜灰霉病、黄瓜菌核病和柑橘炭疽病的生 物防治方法，所述生物防治方法包括向发病的黄瓜叶片、柑橘施用上述绿色木霉菌株TW12 或者上述生物防治粉剂或液体制剂。 实验表明，本专利技术的绿色木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、厚垣孢 子产生率大，抗逆性强，在黄瓜、柑橘叶片能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用 前景。由该绿色木霉菌株TW12制备的生物防治制剂，可以作为防治黄瓜病害的生物农药或 生物肥料，防治多种黄瓜灰霉病、黄瓜菌核病和柑橘炭疽病等。【具体实施方式】 下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。 实施例1 1、绿色木霉菌株TW12的分离与纯化 本专利技术的绿色木霉菌株TW12是从潍坊北部渤海滩涂潮间带的枯木上分离获得 的，分离方法为： ⑴木霉菌株的分离：取潮间带枯木残体，先用75%的酒精局部处理lmin，再在超 净工作台上用紫外灯处理20min后，用灭菌刀片切开处理部位，用接种针挑取少量枯木刮 取物，在PDA平板上划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化木霉菌株，转 至PDA试管斜面保存备用。 (2)厚垣孢子产生率测定：首先在显微镜下进行形态观察，再进行高温活性测试， 确定厚垣孢子抗逆性。 (3)黄瓜灰霉病和柑橘炭疽病高效拮抗木霉菌株的筛选 ①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在木霉菌、黄瓜灰霉病菌、柑橘 炭疽病病菌边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，26°C恒温培养， 逐日观察木霉菌对病原菌的抑制作用。 ②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的木霉菌株进行复筛，主要是经过耐温性、 耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的木霉菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。 本专利技术人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治黄瓜灰霉病、菌核病和柑橘炭 疽病的绿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高产厚垣孢子的绿色木霉(Trichoderma viride)菌株TW12，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.11048。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：牛赡光，张芳，李鹏，李泉涌，张淑静，
申请(专利权)人：潍坊万胜生物农药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37