一种基于气压计检测凝血酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于气压计检测凝血酶的方法，属于分析化学领域。首先在凝血酶的适配体A上修饰过氧化氢酶，再将凝血酶的另一段适配体B修饰在磁珠上，以这两段适配体为捕获识别探针。当存在凝血酶的时候，能形成磁珠/适配体B–凝血酶–适配体A/CAT的三明治结构的聚合物，该聚合物能够受磁场的作用进行迁移富集，使其便于分离纯化；而CAT能够催化过氧化氢溶液分解产生氧气，能引起密闭环境中气压的变化，从而适合于气压计的检测使用。该方法用价格低廉的气压计代替传统的分析检测工具为检测手段；利用凝血酶适配体对目标物凝血酶的特异性高效识别捕获，建立一种检测成本低、操作简单、定量结果准确、能即时快速检测的凝血酶的新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于气压计检测凝血酶的方法
本专利技术涉及一种基于气压计检测凝血酶的方法，属于分析化学领域。技术背景便携式即时检测器一般具有仪器小型、检测成本低、操作简单、定量结果准确、能即时快速检测的特点。相比于传统的分析检测手段，便携式即时检测器在一定程度上摆脱检测分析过程中在时间、空间、设备成本和操作技能上的制约，能够完成低成本、及时、简单、准确的分析检测，是一种对实验检测条件及操作者没有太高要求的分析技术，现已得到人们的关注与重视，并在一定程度上得到了发展。常见的便携式即时检测器有温度计，湿度计，压力计，红外线二氧化碳测定仪以及可燃性气体检测仪等，这些仪器一般都只对应某一种检测对象，如：温度，湿度，二氧化碳，和可燃性气体，目标单一。如果能将便携式即时检测器和传统生物传感技术相结合，则能拓展便携即时检测器的应用范围，同时大大地降低分析检测成本。最成功的例子之一就是血糖仪，这种血糖检测器体积小、方便携带、检测成本低、定量结果准确、操作简便，病人自己根据说明书就可以随时随地进行血糖的检测。为弥补其仅能用于血糖检测的缺点，LU课题组将其与生物传感技术结合，使其能够用于检测乙型肝炎病毒(YuXiang；YiLu，UsingCommerciallyAvailablePersonalGlucoseMetersforPortableQuantificationofDNA.AnalyticalChemistry[J]，2012，84(4):1975–1980)、铅离子和铀离子(YuXiang；YiLu，AninvasiveDNAapproachtowardageneralmethodforportablequantificationofmetalionsusingapersonalglucosemeter[J].ChemicalCommuni-cations，2013,49,585-587)。杨则通过过氧化氢在自制的条状管道中分解引起气体膨胀来对可卡因进行定量测定(ZhiZhu,ZhichaoGuan,ShashaJia，Au@PtNanoparticleEncapsulatedTarget-ResponsiveHydrogelwithVolumetricBar-ChartChipReadoutforQuantitativePoint-of-CareTesting[J].Angewandte-Chemie，2014,53,12503–12507)。凝血酶是一种重要的生理蛋白酶，在血液凝固、炎症和创伤愈合等生理及病理过程中发挥重要作用，其传统的检测方法主要有基于合成底物的酶活性分析(Mann，K.G，AddingthevesselwalltoVirchow’Striad[J].JThrombHaemost，2006.4(1)：58-59.)、免疫分析方法(Rand，M.D.，L0ck，J.B.，vantVeer,C.，Gaffney,D.P.，andMann，K.G，Blooddottinginminimallyalteredwholeblood[J].Blood,1996.88(9)：3432—3445.)和荧光法(HaixinChang，LonghuaTang，YingWang，GrapheneFluorescenceResonanceEnergyTransferAptasensorfortheThrombinDetection[J].Anal.Chem.2010,82,2341–2346)等，但这些方法检测限高，无法满足痕量检测要求，同时仪器大型、成本高难以普及。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于气压计检测凝血酶的新方法，该方法以气压计为检测手段，具有检测器体积小、方便携带、检测成本低、定量结果准确、即时在线检测和操作简便等特点。本专利技术采取的技术方案如下：1、已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程的建立(1)采用过氧化氢酶(CAT)修饰凝血酶的一段DNA适配体A，得到最终浓度为0.3μMCAT-DNA适配体A溶液；(2)将修饰有链霉亲和素(streptavidin下称SA)的磁珠加入含有0.1MNaCl和0.05％Tween-20的0.1MpH＝7.3的PBS缓冲液中，再加入经生物素(Vh)修饰的凝血酶的一段DNA适配体B，室温振荡30分钟，洗涤定容，得到最终浓度为0.3μM，修饰在磁珠上的DNA适配体B溶液；(3)将步骤(1)制备的CAT-DNA适配体A溶液与修饰在磁珠上的DNA适配体B溶液按等体积的比例混合，加入含有已知浓度的凝血酶的待测溶液，室温培育1.5～2个小时，由于步骤(2)中加入经生物素(Vh)修饰的凝血酶的一段DNA适配体B对凝血酶的特异性识别并结合，形成“DNA适配体B-凝血酶-CAT-DNA适配体A”样品聚合物；(4)利用磁铁对步骤(3)中得到的样品聚合物进行分离纯化，即用含有0.1MNaCl和0.05％Tween-20的PBS缓冲液对样品聚合物进行洗涤，而后将经洗涤的样品聚合物装入样品杯，样品杯靠近磁铁，使溶液中的“DNA适配体B-凝血酶-CAT-DNA适配体A”聚合物聚集于样品杯杯壁，如此反复3-5次，即得到经过纯化的“DNA适配体B-凝血酶-CAT-DNA适配体A”聚合物；(5)将上述步骤得到经过纯化的“DNA适配体B-凝血酶-CAT-DNA适配体A”聚合物加入自制的反应器中与过氧化氢溶液反应，用气压计检测反应器中压力值。(6)采用上述(1)～(5)相同的步骤，对另一已知浓度的凝血酶溶液进行处理；如此重复，得到一系列已知浓度的凝血酶溶液对应的反应后的气体压力值；(7)以已知浓度的凝血酶溶液浓度(x)为横坐标点，对应的气压值(y)为纵坐标点，建立直角坐标系；将相邻坐标点(x，y)连接，建立已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程：y＝kx+b。其中y为气压值，x为凝血酶浓度。2、待测凝血酶样品的预处理和气压值的获得采用“已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程”中(1)～(6)相同的步骤，对未知浓度的凝血酶溶液进行处理，得到对应的气体压力值；3、待测凝血酶样品浓度的获得根据线性方程：y＝kx+b，将通过“待测样品的预处理和气压值的获得”中得到的待测样品的气压计值代入方程，计算得到待测凝血酶样品的浓度。步骤(1)中所述的修饰有过氧化氢酶的凝血酶DNA适配体A的序列为从左到右5’到3’：HS-TTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG。步骤(2)中所述的修饰有生物素的凝血酶DNA适配体B的序列为从左到右5’到3’：生物素-CCCCCACGTTGTAAAACGACGGCCAGT。步骤(5)中所述的自制反应器反应器为一个广口玻璃瓶，以带有两根导管的橡胶塞为密闭盖，其中一根导管与精密型的气压计相连，另一根则装有阀门，阀门打开时能使反应器与大气连通；首先在广口玻璃瓶注入过氧化氢溶液，而后将装有样品聚合物的样品杯垂直放入广口瓶内的侧壁，并利用广口玻璃瓶外的磁铁吸力，保持样品杯处于竖立状态。关闭阀门，此时气压表上的显示数值为0.00KPa。移去磁铁，则样品杯倾倒，小管中样品聚合物与过氧化氢溶液接触，反应促发，释放出气体，反应器中气压增大。待气压表显示的数值稳定后，记录数据，即得到该样品聚合物所对应的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于气压计检测凝血酶的方法，其特征是：（1）已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程的建立①采用过氧化氢酶修饰凝血酶的一段DNA适配体A，得到最终浓度为0.3µM CAT‑DNA适配体A溶液；②将修饰有链霉亲和素的磁珠加入含有0.1M NaCl和0.05% Tween‑20的0.1M pH=7.3的PBS缓冲液中，再加入经生物素修饰的凝血酶的一段DNA适配体B，室温振荡30分钟，洗涤定容，得到最终浓度为0.3µM，修饰在磁珠上的DNA适配体B溶液；③将步骤①制备的CAT‑DNA适配体A溶液与修饰在磁珠上的DNA适配体B溶液按等体积的比例混合，加入含有已知浓度的凝血酶的待测溶液，室温培育1.5～2个小时，由于步骤②中加入经生物素修饰的凝血酶的一段DNA适配体B对凝血酶的特异性识别并结合，形成“DNA适配体B‑凝血酶‑CAT‑DNA适配体A”样品聚合物；④利用磁铁对步骤③中得到的样品聚合物进行分离纯化，即用含有0.1M NaCl和0.05% Tween‑20的PBS缓冲液对样品聚合物进行洗涤，而后将经洗涤的样品聚合物装入样品杯，样品杯靠近磁铁，使溶液中的“DNA适配体B‑凝血酶‑CAT‑DNA适配体A”聚合物聚集于样品杯杯壁，如此反复3‑5次，即得到经过纯化的“DNA适配体B‑凝血酶‑CAT‑DNA适配体A”聚合物；⑤将上述步骤得到经过纯化的“DNA适配体B‑凝血酶‑CAT‑DNA适配体A”聚合物加入自制的反应器中与过氧化氢溶液反应，用气压计检测反应器中压力值。⑥采用上述①～⑤相同的步骤，对另一已知浓度的凝血酶溶液进行处理；如此重复，得到一系列已知浓度的凝血酶溶液对应的反应后的气体压力值；⑦以已知浓度的凝血酶溶液浓度（x）为横坐标点，对应的气压值（y）为纵坐标点，建立直角坐标系；将相邻坐标点（x ，y）连接，建立已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程：y=kx+b，其中y为气压值，x为凝血酶浓度；（2）待测凝血酶样品的预处理和气压值的获得采用“已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程”中①～⑥相同的步骤，对未知浓度的凝血酶溶液进行处理，得到对应的气体压力值；（3）待测凝血酶样品浓度的获得根据线性方程：y=kx+b，将通过“待测样品的预处理和气压值的获得” 中得到的待测样品的气压计值代入方程，计算得到待测凝血酶样品的浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种基于气压计检测凝血酶的方法，其特征是：（1）已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程的建立①采用过氧化氢酶修饰凝血酶的一段DNA适配体A，得到最终浓度为0.3μMCAT-DNA适配体A溶液；②将修饰有链霉亲和素的磁珠加入含有0.1MNaCl和0.05%Tween-20的0.1MpH=7.3的PBS缓冲液中，再加入经生物素修饰的凝血酶的一段DNA适配体B，室温振荡30分钟，洗涤定容，得到最终浓度为0.3μM，修饰在磁珠上的DNA适配体B溶液；③将步骤①制备的CAT-DNA适配体A溶液与修饰在磁珠上的DNA适配体B溶液按等体积的比例混合，加入含有已知浓度的凝血酶的待测溶液，室温培育1.5～2个小时，由于步骤②中加入经生物素修饰的凝血酶的一段DNA适配体B对凝血酶的特异性识别并结合，形成“DNA适配体B-凝血酶-CAT-DNA适配体A”样品聚合物；④利用磁铁对步骤③中得到的样品聚合物进行分离纯化，即用含有0.1MNaCl和0.05%Tween-20的PBS缓冲液对样品聚合物进行洗涤，而后将经洗涤的样品聚合物装入样品杯，样品杯靠近磁铁，使溶液中的“DNA适配体B-凝血酶-CAT-DNA适配体A”聚合物聚集于样品杯杯壁，如此反复3-5次，即得到经过纯化的“DNA适配体B-凝血酶-CAT-DNA适配体A”聚合物；⑤将上述步骤得到经过纯化的“DNA适配体B-凝血酶-CAT-DNA适配体A”聚合物加入自制的反应器中与过氧化氢溶液反应，用气压计检测反应器中压力值；⑥采用上述①～⑤相同的步骤，对另一已知浓度的凝血酶溶液进行处理；如此重复，得到一系列已知浓度的凝血酶溶液对应的反应后的气体压力值；⑦以已知浓度的凝血酶溶液浓度（x）为横坐标点，对应的气压值（y）为纵坐标点，建立直角坐标系；将相邻坐标点（x，y）连接，建立已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程：y=kx+b，其中y为气压值，x为凝血酶浓度；（2）待测凝血酶样...

【专利技术属性】
技术研发人员：王清萍，李荣杰，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35