本发明专利技术公开了一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，首先用阴离子树脂吸附去冷胶血浆中的凝血酶原，后洗脱、过滤得到凝血酶原溶液；再用 CaCL2 溶液激活凝血酶原，得到凝血酶溶液；然后对凝血酶溶液进行S/D病毒灭活处理；用阳离子柱进行层析，得到纯化的凝血酶溶液；将凝血酶溶液进行超滤、透析、浓缩，得到效价符合产品规格要求的凝血酶溶液；然后用20nm滤芯进行除病毒过滤；再用0.22µm滤芯进行除菌过滤，后按所需规格进行分装；然后冻干；将冻干粉进行干热病毒灭活处理获得人凝血酶成品。本发明专利技术采用一步阳离子柱纯化凝血酶，操作简单，凝血酶比活高，用三步病毒灭除方式保证了产品临床使用的安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，涉及一种人凝血酶，具体来说是一种从去冷胶血浆中 制备人凝血酶的方法。
技术介绍
人凝血酶（human thrombin)是一种丝氨酸蛋白酶，分子量37KD，由1条3kD的轻 链和另1条31kD的重链通过二硫键连接而成，主要功能是将可溶性的纤维蛋白原水解成不 溶性的纤维蛋白，并通过激活凝血因子XIII使纤维蛋白交联形成网状，从而起到止血的作 用。正常情况下，人血液循环中的凝血酶以非活化的形式即以凝血酶原存在，在体内或体表 出现出血倾向时，凝血酶原通过一系列复杂的过程转换成具有活化形式的凝血酶。利用现 代生物制药技术，可以将血浆中所含的凝血酶原制成冻干人凝血酶，常以干粉或溶液局部 涂于伤口及手术处来控制毛细血管血液渗出，如骨出血及扁桃腺摘除和拔牙时出血等。进 行局部止血时，常用氯化钠注射液溶解成50~200IU/mL的溶液喷雾或用本品干粉喷洒于 创面，有时也可口服，用于胃和十二指肠出血。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯 的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位止血。凝血酶另一个 广泛的用途在于与人纤维蛋白原配伍，组成人纤维蛋白粘合剂，利用双联给药装置将凝血 酶与纤维蛋白原混合后喷射至创口处瞬间成胶止血。其中的凝血酶可不经过血液凝固的前 期阶段而直接使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，使血液快速凝固、填塞出血点而达到止血目 的，故可适用于各种原因引起的出血症状，如消化道、气管、各种手术出血等，近年在组织修 复、肿瘤靶位治疗等领域也有相关的研究进展，因此，随着该药临床使用日渐广泛，凝血酶 的生产技术显得越来越重要。 凝血酶的制备通常是经过一系列工序获得凝血酶原的粗品，然后用特定方式进行 激活，使凝血酶原转变为凝血酶，再对凝血酶进行纯化，经超滤、浓缩获得凝血酶原液，按所 需规格进行无菌分装，然后进行冻干，最后获得冻干粉成品.按最新药典要求整个制备过 程中必须经过脂包膜病毒和非脂包膜病毒的灭活或去除步骤。 提取凝血酶原的原料有血浆、去冷胶血浆及cohn组分三沉淀等，由于血浆中含有 人凝血因子VIII，如果从血浆中直接制备凝血酶，则对人凝血因子VIII的生产造成影响， 而从组分三沉淀中制备凝血酶，虽然利用了废弃沉淀，但由于cohn组分三沉淀已经过三次 乙醇沉淀，凝血酶原损失较多，且由于乙醇的存在，凝血酶原的稳定性也受到一定损害，故 以cohn组分三沉淀为起始原料的凝血酶制备工艺，得率较低，制品稳定性较差，特别是，如 果血制品生产线已含有从去冷胶血浆中生产凝血酶原复合物（PCC)的生产线设置，则凝血 酶原即凝血因子II大部分被提取，组分III沉淀中几乎不含凝血酶原，此时组分III就不 再适合做为凝血酶的起始原料了。所以，综合考虑，以去冷胶血浆为原料制备凝血酶是较佳 选择。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种从去冷胶血浆中制备人凝血 酶的方法，所述的这种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法解决了现有技术的制备人凝血 酶的方法工艺流程复杂、激活条件苛刻、生产周期长、病毒灭活不彻底及制品外观不佳的技 术问题。 本专利技术提供了，包括如下步骤： 1) -个用阴离子树脂吸附去冷胶血浆中的凝血酶原的步骤；根据去冷胶血浆的 体积，称取阴离子树脂，所述阴离子树脂和去冷胶血浆的质量体积比为〇. 5-1. 5g :1L，将阴 离子树脂用热注射用水充分溶胀，所述的热注射用水的温度不低于70°C，然后再用冷注射 用水冷却，所述的冷注射用水的温度为10~25°C，然后用平衡缓冲液A平衡后加到去冷胶 血浆中，在10-30°C，缓慢搅拌0. 5-1. 5小时，用滤网过滤，收集树脂，滤出的血浆进入后续 产品的加工程序中； 2)用平衡缓冲液A连续冲洗树脂，平衡缓冲液A用量为溶胀后的阴离子树脂质量 的4-8倍，然后用洗脱缓冲液A缓慢、连续洗脱树脂，洗脱缓冲液A用量为溶胀后的阴离子 树脂质量的2-6倍，收集洗脱液即为凝血酶原溶液； 3) -个激活凝血酶原的步骤；在10~30°C条件下，在上述洗脱液中加入娃藻土， 所述的硅藻土的质量为上述洗脱液质量的0. 1~1 %，搅拌0. 5-1小时，加入0. 5-1M CaCL2 溶液，温和搅拌2-10小时，将凝血酶原激活； 4)加入质量百分比浓度为25-50%聚乙二醇溶液，所述的聚乙二醇的加入量为步 骤3)溶液的2-8%，搅拌0. 5-2小时； 5)过滤，后洗滤芯，收集滤液即凝血酶溶液，弃去沉淀； 6) -个采用S/D病毒灭活处理的步骤，在上述的滤液中加磷酸三丁脂，所述的磷 酸三丁脂的加入量为所述的滤液的〇? 3%，然后加入Tween-80,所述的Tween-80的加入量 为所述的滤液的1%，在24-26°C下缓慢搅拌6~7小时； 7) -个采用阳离子柱层析纯化凝血酶的步骤，将以上溶液降温至5~20°C，上阳 离子柱进行层析；先用平衡缓冲液B进行洗涤；再用洗脱缓冲液B进行洗脱，收集洗脱液， 即纯化的凝血酶溶液；在洗脱液中及时加入稳定剂，所述的稳定剂的质量为凝血酶溶液的 1-5% ； 8)用0.45 ym滤芯进行澄清过滤，收集滤液；后进行超滤浓缩并透析，最后浓缩至 合适的活力单位； 9)加入稳定剂，所述的稳定剂的质量为上述超滤浓缩溶液的1-5%;按产品规格调 节凝血酶溶液效价至500-550IU/ml，调PH值至6. 50-7. 50 ; 10)用0. 10 ym的滤芯串联20nm的除病毒滤芯进行除病毒过滤，过滤的温度为 5 ~25。。； 11)用0. 22 ym的滤芯进行除菌过滤，后分装； 12) -个冻干的步骤； 13) -个进行干热病毒灭活的步骤；将冻干粉在100°C水浴中加热30分钟，进行干 热病毒灭活处理获得人凝血酶。 进一步的，所述的阴离子树脂为DEAE-Sephadex A-50树脂。 进一步的，步骤2)中所述的连续洗涤或洗脱是指在在树脂桶中，一边搅拌一边加 入洗涤或洗脱缓冲液，同时从树脂桶底阀排出洗涤液或洗脱液的过程。 进一步的，所述的平衡缓冲液A由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的平衡缓 冲液A中，所述的柠檬酸钠的浓度为0. 01-0. 02M，所述的NaCL的浓度为0. 1-0. 2M，PH为 6. 50-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液A由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的洗脱缓冲液A中， 所述的柠檬酸钠的浓度为〇. 01-0. 02M，所述的NaCL的浓度为0. 5-1. 0M，所述的洗脱缓冲溶 液的 PH6. 50-7. 50。 进一步的，所述的平衡缓冲液B由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的平衡缓 冲液B中，所述的柠檬酸钠的浓度为0. 01-0. 02M，所述的NaCL的浓度为0. 1-0. 2M，PH为 6. 60-7. 50 ;所述的洗脱缓冲液B由柠檬酸钠和NaCL水溶液组成，所述的洗脱缓冲液B中， 所述的柠檬酸钠的浓度为〇. 01-0. 02M，所述的NaCL的浓度为0. 5-1. 5M，所述的缓冲溶液的 PH6. 60-7. 50。 进一步的，步骤3)中，所述的CaCL2的最终浓度为0. 02M-0. 2M ; 进一步的，步骤7)所述的阳离子树脂是CM-Sepharose FF，SP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法，其特征在于包括如下步骤：1）一个用阴离子树脂吸附去冷胶血浆中的凝血酶原的步骤；根据去冷胶血浆的体积，称取阴离子树脂，所述阴离子树脂和去冷胶血浆的质量体积比为0.5‑1.5g：1L，将阴离子树脂用热注射用水充分溶胀，所述的热注射用水的温度为不低于70℃，然后再用冷注射用水冷却，所述的冷注射用水的温度为10~25℃，然后用平衡缓冲液A平衡后加到去冷胶血浆中，在10‑30℃，缓慢搅拌0.5‑1.5小时，用滤网过滤，收集树脂，滤出的血浆进入后续产品的加工程序中；2）用平衡缓冲液A连续冲洗树脂，平衡缓冲液A用量为溶胀后的阴离子树脂质量的4‑8倍，然后用洗脱缓冲液A缓慢、连续洗脱树脂，洗脱缓冲液A用量为溶胀后的阴离子树脂质量的2‑6倍，收集洗脱液即为凝血酶原溶液；3）一个激活凝血酶原的步骤；在10~30℃条件下，在上述洗脱液中加入硅藻土，所述的硅藻土的质量为上述洗脱液质量的0.1~1%，搅拌0.5‑1小时，加入0.5‑1M CaCL2 溶液，温和搅拌2‑10小时，将凝血酶原激活；4）加入质量百分比浓度为25‑50%聚乙二醇溶液，所述的聚乙二醇的加入量为步骤3）溶液的2‑8%，搅拌0.5‑2小时；5）过滤，后洗滤芯，收集滤液即凝血酶溶液，弃去沉淀；6）一个采用S/D病毒灭活处理的步骤，在上述的滤液中加磷酸三丁脂，所述的磷酸三丁脂的加入量为所述滤液的0.3%，然后加入Tween‑80，所述的Tween‑80的加入量为所述滤液的1%，在24‑26℃下缓慢搅拌6~7小时；7）一个采用阳离子柱层析纯化凝血酶的步骤，将以上溶液降温至5~20℃，上阳离子柱进行层析；先用平衡缓冲液B进行洗涤；再用洗脱缓冲液B进行洗脱，收集洗脱液，即纯化的凝血酶溶液；在洗脱液中及时加入稳定剂，所述的稳定剂的质量为凝血酶溶液的1‑5%；8）用0.45µm滤芯进行澄清过滤，收集滤液；后进行超滤浓缩并透析，最后浓缩至合适的活力单位；9）加入稳定剂，所述的稳定剂的质量为上述超滤浓缩溶液的1‑5%；按产品规格调节凝血酶溶液效价至500‑550IU/ml，调PH值至6.50‑7.50；10）用0.10µm的滤芯串联20nm的除病毒滤芯进行除病毒过滤，过滤的温度为5~25℃；11）用0.22µm的滤芯进行除菌过滤，后分装；12）一个冻干的步骤；13）一个进行干热病毒灭活的步骤；将冻干粉在100℃水浴中加热30分钟，进行干热病毒灭活处理获得人凝血酶成品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李春洲，
申请(专利权)人：上海洲跃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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