VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白及其用途制造技术

提供的是VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白及其用途。更具体地，提供了包含VEGFR胞外配体结合结构域和PDGFRβ抗体片段的双功能融合蛋白，可用于治疗湿性老年性黄斑变性(AMD)以及其它任何能够通过抑制VEGF和PDGF信号通路改善的疾病，比如肿瘤和糖尿病视网膜病变。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白及其用途
本专利技术涉及一种VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白，包含其药物组合物及其用途。
技术介绍
老年性黄斑变性(AMD)是一种致残、致盲性疾病。其主要影响黄斑区或视网膜中负责高视敏度视力的中心区域，并且是导致老年人不可逆性视力丧失的原因。据统计，全世界超过3000万人罹患此病。随着中国人口老龄化逐渐加剧，目前该疾病已严重危害我国人民群众的生命健康。AMD有两种形式，干性AMD和湿性AMD。虽然干性AMD更常见，但一般导致较轻的、较缓慢的视力丧失。湿性AMD患者的视网膜之下生成新血管。当感光细胞和视网膜色素上皮细胞(RPE)细胞慢慢退化时，血管趋于从脉络膜中的正常位置发展到视网膜之下的异常位置。这种异常的新血管生长被称为脉络膜新生血管(CNV)。这些异常血管渗漏流血，导致出血、肿胀、瘢痕组织和严重的视力丧失。只有10％左右的AMD患者是湿性类型，但是却大约占AMD所导致的失明总数的90％。湿性老年视黄斑变性(AMD)已经成为65岁以上老年人失明的首要威胁。目前批准用于治疗湿性AMD的治疗方法包括激光凝固法、光动力疗法和用于降低过剩VEGF的水平、或阻断VEGF生成的抗血管药物疗法。根据部位，有时可以使用激光治疗来破环湿性AMD中形成的异常血管。只有15％的湿性AMD适合采用激光治疗，因为血管不能离黄斑部的中内区域太近。激光是光束，由血液色素、药物和PRE细胞所吸收，并转化为热能而烧灼异常血管。由于刺激物依然没有被去除，新生血管形成时常反复，导致视力丧失。光动力疗法主要通过静脉注入光敏药物，继而采用特定波长的非热能激光照射脉络膜新生血管病灶，将光敏药物活化。用光动力疗法治疗湿性AMD，只能稳定或降低湿性AMD视力下降的风险。由于并非对因治疗，光动力疗法不能阻止复发的可能，一般需要多次治疗。而且，治疗后要避光48小时，以免发生光敏反应，造成皮肤灼伤。因此，给患者带来很多痛苦。血小板衍生生长因子家族包括血小板生长因子(PDGF)和血管内皮细胞因子(VEGF)。每种生长因子均可由多种细胞产生，其受体均为酪氨酸激酶(RTK)型受体。血小板衍生生长因子家族成员包括：PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD、胎盘生长因子(Placentalgrowthfactor，PGF)以及血管内皮生长因子(VEGF、VEGF41、VEGFB、VEGFC、FIGF(也作VEGFD))等。VEGF是血管内皮细胞强有力和特有的促有丝分裂原，可促进血管生成过程的所有环节。在几个研究血管生成的体内试验中，VEGF均可诱导血管新生。在对体外培养的血管和淋巴管内皮细胞的试验中，VEGF能促进内皮细胞增殖、迁移及管状结构形成。VEGF可以增加毛细血管及后微静脉的渗透性。皮肤或肌肉注射后，能迅速诱导连续性的内皮结构破坏(XieK，WeiD，HuagS.Transcriptionalanti-angiogenesistherapyofhumanpancreaticcancer[J].CytokineGrowthFactorRev2006，17：147-156)。各VEGF受体(VEGFR)的作用有所不同。VEGFR-2起着调节内皮生长、分化、渗透性的作用；而VEGFR-1则与调节内皮细胞移动、聚集有关，并且通过VEGFR-2抑制信号的传导。VEGFR-3对于血管发育可能也有作用，但更独特的是其在淋巴管组织中表达，可能对淋巴系统生成有重要作用(JoukovV，PajusolaK，KaipainenA，etal.AnovelvascularendothelialgrowthfactorVEGF-CisaligandfortheFlt4andKDRreceptortyrosinekinases[J].EMBOJ，2003，15(2)：290-298)。VEGF通过VEGFR发挥生物学效应。VEGF与VEGFR结合，使VEGFR二聚体化、自我磷酸化，通过多个细胞内途径传递信号(包括MAPK、PI3激酶、Ras和磷脂酶C途径等)，最终发挥作用。迄今，已发现VEGF有3个受体VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)。前两者主要在内皮细胞中表达，在肿瘤细胞中也有表达，而VEGFR-3主要在淋巴管组织中表达。其中前2个受体与VEGF-A亲和力高，属酪氨酸激酶家族。与VEGF-A结合导致其本身二聚化、胞内段酪氨酸自磷酸化、随后激活下游信号蛋白而发挥其生理功能。前两者主要在内皮细胞中表达，在肿瘤细胞中也有表达，而VEGFR-3主要在淋巴管组织中表达(OhH.Anovelmolecularmechanisminvolvingneuropilin-1forvascularendothelialgrowthfactor-inducedretinalangiogenesis.NipponGakkaiZasshi.2003-Nov：107(11)：651-656)。已知VEGF是与眼内病症有关的新血管生成过程中关键的调节因子。眼液中VEGF水平与糖尿病患者和其它缺血性视网膜病患者的活性血管增生水平密切相关。其它研究证明了在AMD患者脉络膜新生血管膜中存在VEGF。目前批准的用于治疗湿性AMD的抗血管药物，目的在于中和VEGF的作用，从面阻断血管新生。例如：辉瑞的哌加他尼钠(Pegaptanib，商品名Macugen)，其活性成分哌加他尼钠是一种由28个核苷酸组成的“aptamer”，其三维结构使其能与细胞外的血管内皮生长因子受体(VEGF)结合，抑制VEGF与相应的受体结合。需要每六周经玻璃体内注射施用；诺华的兰尼单抗(Ranibizumab，商品名Lucentis)，Lucentis中的活性成分兰尼单抗是一种与VEGF结合的抗体片段，需要每个月进行玻璃体内注射；拜耳的艾力亚(VEGF-Trap-eye，商品名Eylea)，其活性成分阿普西柏是一种与VEGF结合的多肽片段，需要头三个月每个月注射，之后每两个月注射施用。但目前的标准药物治疗对相当一部分患者无效，比如目前标准的Ranibizumab治疗只能提高1/3患者的视力，10％患者对该治疗无反应；另外，大概70％患者经过抗VEGF治疗后无明显的视力增加。目前的药物治疗还存在适应性抗性，也就是患者在经过一段时间治疗后对该治疗药物产生了抗性。同时由于目前的治疗是通过眼内注射，每一次注射都不仅产生昂贵的治疗费用，也会引起眼内感染，出血以及视网膜脱离，其中最值得重视的并发症是眼内感染。一旦感染，后果不堪设想，有可能会失明。因此注射频度的降低对于药物的发展亦有重要意义。因此，这个领域需要更有效的治疗，克服抗VEGF治疗的抗性，以及延长抗VEGF药物作用的时间(不需要一个月或者两个月的眼底注射)，以期更有效，更安全。血小板衍生因子PDGF是创伤愈合过程中较早出现的生长因子之一。在创面愈合的全过程中起重要作用，主要表现在促进创面愈合方面。常见的PDGF是由两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体，这使PDGF具有多种形式的二聚体结构，即PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC以及PDGF-DD。P本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.24 CN 20141003382151.一种双特异性融合蛋白，包括VEGF结合肽、PDGFRβ结合肽和免疫球蛋白IgG的Fc段，还包括隔区，其中所述的双特异性融合蛋白的氨基酸序列选自：SEQIDNO:19至SEQIDNO:24。2.一种如权利要求1所述的双特异性融合蛋白的制备方法，包括：构建表达载体，将表达载体转化至宿主细胞，在宿主细胞中表达，得到表达前体，将双特异性融合蛋白分泌到细胞外，得到所述的双特异性融合蛋白。3.一种用于制备如权利要求1所述的双特异性融合蛋白的表达前体，其中所述表达前体由信号肽和如权利要求1所述的双特异性融合蛋白组成；所述信号肽的氨基酸序列选自SEQIDNO:16或SEQIDNO:17；所述信号肽位于所述双特异性融合蛋白的N端。4.一种编码如权利要求3所述的表达前体的多核苷酸。5.一种含有如权利要求4所述的多核苷酸的表达载体。6.一种含有如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：屈向东，曹国庆，叶鑫，陈侃，张蕾，许志宾，袁纪军，张连山，潘琴，管雁宾，
申请(专利权)人：上海恒瑞医药有限公司，江苏恒瑞医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31