本发明专利技术公开了短效因子VII肽。缩短的半衰期是急性出血和类似障碍的治疗所期望的。因子VII及其变体的唾液酸化和/或糖基化的修饰产生了可用于治疗急性出血病症的肽。本文中提供了人凝固因子VII变体和编码这样的变体的多核苷酸，包含和表达这样的变体的载体和宿主细胞，得到这样的变体的方法，使用这样的变体的方法，所述变体的组合物，和与之相关的其他发明专利技术特征。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请的交叉引用 本申请要求2012年12月24日提交的美国申请序号61/745, 674和2013年3月15日 提交的美国申请序号61/787, 026的优先权，它们在此通过引用整体并入。
本文中提供了人凝固因子VII变体和编码这样的变体的多核苷酸，包含和表达这 样的变体的载体和宿主细胞，得到这样的变体的方法，使用这样的变体的方法，所述变体的 组合物，和与之相关的额外专利技术特征。
技术介绍
血液凝固是由各种血液组分（或因子）的复杂相互作用组成的过程，所述复杂相 互作用最终产生纤维蛋白凝块。通常，参与已被称为凝固"级联"的血液组分是在酶促方面 失活的蛋白质（前酶或酶原），其通过活化剂（其自身是活化的凝固因子）的作用而转化成 蛋白水解酶。已经经历这样的转化的凝固因子一般被称为"活性因子"，并且通过向凝固因 子的名称添加字母"a"来命名（例如，因子Vila)。 止血过程的开始由组织因子（其在血管壁损伤以后暴露于循环血液）和因子 Vila(其以对应于总因子VII蛋白质量的约1%的量存在于循环中）之间的复合物的形成介 导。该复合物锚定至带有组织因子的细胞并在细胞表面上将因子IX和X转化成它们的活 性形式因子IXa和因子Xa。因子Xa在带有组织因子的细胞上将凝血酶原转化成凝血酶，所 述凝血酶活化因子VIII、因子V、因子XI和因子XIII。此外，在止血的该初始步骤中形成的 有限量的凝血酶也活化血小板。在凝血酶作用于血小板以后，血小板改变形状并将带电荷 的磷脂暴露在它们的表面上。该活化的血小板表面形成其它因子X活化和完整凝血酶产生 的模板。在活化的血小板表面上的其它因子X活化经由在活化的血小板的表面上形成的因 子IXa和因子Villa复合物而发生，且因子Xa然后将凝血酶原转化成凝血酶，同时仍然在 表面上。凝血酶然后将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，所述纤维蛋白是不溶性的且稳定化最 初的血小板栓。该过程定位至组织因子暴露部位，由此使凝固系统的全身活化的风险最小 化。近年来，已经发现因子VII和组织因子是血液凝固的主要引发剂。 因子Vila从它的前体因子VII产生，所述因子VII是在肝脏中合成并分泌进血液 中，它在血液中作为单链糖蛋白（约50, 000 Da的分子量）进行循环。本文中使用的野生 型因子VII具有在图1和2中公开的氨基酸序列和核苷酸序列。术语"因子VII"意在包括 处于它们的未切割形式（酶原形式）的因子VII多肽以及已经蛋白水解地或以其它方式加 工以产生它们各自的生物活性形式（其可以被称作因子Vila)的那些。野生型因子VII通 常在残基152和153之间被切割以产生因子Vila。 因子VII在体外被因子Xa、因子Xlla、因子IXa或凝血酶转化成双链形式因子 Vila。象参与止血的几种其它血浆蛋白一样，因子VII的活性依赖于维生素K，其是簇集在 该蛋白的氨基端附近的多个谷氨酸残基的Y-羧基化所必需的。这些Y-羧化的谷氨酸是 金属离子诱导的因子VII与磷脂的相互作用所必需的。在有组织因子、磷脂和钙离子存在 下，双链因子Vila通过有限的蛋白酶解快速地活化因子X或因子IX。因子Vila易于发生 蛋白水解性裂解，从而产生许多不具有凝固活性的降解产物。 已经公开了因子VII变体，其具有通过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入 而从野生型因子VII衍生出的氨基酸序列。例如，Dickinson等人（Proc. Natl. Acad. Sci USA (1996) 93，14379-14384)涉及因子 VII 变体，其中 Lysl57、Vall58、Glu296、Met298、 Asp334、Ser336 或 Lys227 已经个别地被 Ala 替换。Iwanaga 等人（Thromb. Haemost. (1999年8月增刊），466，摘要1474)涉及因子Vila变体，其中残基316-320缺失或残基 311-322被得自胰蛋白酶的对应残基替换。Bolt等人的美国专利申请公开2008/0058255 A1涉及在N145或N322处、或者在N145和N322二者处具有破坏糖基化的取代的因子VII 变体。Toso等人报道了一系列基于天然存在的突变的因子VII结构-功能研究。突变 体重组因子VII蛋白包括T324M、E385K和两种在因子VII重链（N322Q)或因子VII轻链 (N145Q)中缺少糖基化核心序列的突变体因子VII蛋白。Toso等人，"Lack of Heavy Chain Glycosylation in Patient with Factor VII Deficiency Not Responsible for Mutant FVIIa Activity,'Blood,第96 卷，第 11 期，第 2 部分（2000 年 11 月 16 日）， 第 79b 页（美国血液学会第 42 届年会（42nd Annual Meeting of the American Society of Hematology))。 大多数天然存在的肽和蛋白含有碳水化合物部分，所述碳水化合物部分沿着肽或 蛋白主链的长度经由与选定数目的氨基酸的特定键而连接至所述肽或蛋白。因而，许多天 然存在的肽和蛋白分别被称作"糖肽"或"糖蛋白"。在任何给定的肽或蛋白上的糖基化模 式的变异性可以影响该肽或蛋白的功能。例如，在肽或蛋白上的N-连接的聚糖的结构可以 影响肽或蛋白的多种特征，包括蛋白酶易感性、细胞内运输、分泌、组织靶向、生物半衰期以 及所述肽或蛋白在细胞或生物体中的抗原性。这些特征中的一种或多种的改变可以影响肽 或蛋白在它的天然场合中的效力，且也可以影响肽或蛋白作为治疗剂的效力（在所述肽或 蛋白已经为该目的而制备的情况下）。 与肽或蛋白链连接的碳水化合物结构被称作"聚糖"分子。存在于肽或蛋白上的 具体聚糖结构影响肽或蛋白的可溶性和聚集特征、肽或蛋白主链的折叠，且因此影响它的 功能或酶活性、肽或蛋白对蛋白水解性攻击的抵抗力、以及导致无活性形式的肽或蛋白向 活性形式的转化的蛋白酶解的控制。例如，存在于聚糖分子上的末端唾液酸残基影响肽或 蛋白在哺乳动物循环系统中的半衰期的长度。其聚糖不含有末端唾液酸残基的肽和蛋白通 常被肝脏更快速地从循环中除去。 在天然存在的糖肽和糖蛋白中发现的聚糖结构通常分成两类：N-连接的聚糖和 〇-连接的聚糖。野生型因子Vila含有两个N-连接的糖基化位点和两个0-连接的糖基化 位点。N-连接的糖基化是在真核生物中最常见的共价修饰。N-连接的糖基化发生在共有 序列Asn-X-Ser/Thr处，在该处聚糖连接至天冬酰胺的胺基，且X代表除了脯氨酸以外的任 何氨基酸。N-连接的聚糖是基于共同核心戊糖Man 3(GlcNAc)2，其可以通过添加单糖（诸如 N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰基葡糖胺、果糖、甘露糖和岩藻糖）而进一步 修饰。具有不同单糖（包括末端唾液酸）的Man 3(GlcNAc)^心可以经由N-乙酰基葡糖胺 连接在Asn-X-Ser/Thr共有序列的Asn处。该化学上复杂的共翻译修饰用于多个目的，并 以多种方式（包括适当折叠、官能团取向和清除率）影响蛋白的本文档来自技高网...
【技术保护点】
变体因子VII多肽的组合物，所述变体因子VII多肽包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有至少2个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少2个序列改变是(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基；其中缀合的唾液酸的摩尔数/N‑连接的聚糖的摩尔数的比率是在选自以下的范围内：(1) 0‑5；(2) 0‑4；(3) 0‑3；(4) 0‑2；(5) 0‑1和(6) 0‑0.5。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：M鲍宗，T赫米斯顿，
申请(专利权)人：拜尔健康护理有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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