棉花离子通道类蛋白及其编码基因和应用制造技术

提供了源自棉花的离子通道蛋白NHX1-2及其编码基因，还提供了NHX1-2在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】棉花离子通道类蛋白及其编码基因和应用
本专利技术涉及离子通道类蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的离子通道类蛋白NHX1-2及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。
技术介绍
盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一，盐渍土壤通常以钠盐、钙盐或镁盐为主，成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要因素。世界上盐碱土的面积约有4亿公顷，占灌溉农田的1/3。盐碱地在中国分布广泛，现有盐碱地面积约0.4亿公顷。随着我国人口增加，耕地减少，盐碱地资源的开发利用有着极其重要的现实意义。而植物抗盐碱、耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经济和生态价值的植物种或品系的选育，则是利用盐碱地经济、有效的措施。对绝大多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3％以下的土壤上，土壤中过量的Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得了很多新进展，特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面，使该领域的研究有了突破性的进展(ZhuJK.2002.Saltanddroughtstresssingaltransductioninplants.Annu.Rev.PlantBiol.53：1247-1273；ZhangZL.2011.ArabidopsisFloralInitiatorSKB1ConfersHighSaltTolerancebyRegulatingTranscriptionandPre-mRNASplicingthroughAlteringHistoneH4R3andSmallNuclearRibonucleoproteinLSM4Methylation.PlantCell，23：396-411)。高等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变化，从而将胞外的信号变为胞内信号，通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细胞核内，激活转录因子，而激活转录因子再作用于功能基因，启动逆境应答基因的表达从而提高植物的耐逆性。尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究，但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。例如，植物抗盐的关键因子仍未找到；植物耐盐的分子机制并不十分清楚。
技术实现思路
本专利技术人利用SSH与RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个离子通道类蛋白(本文命名为NHX1-2)的编码基因的DNA序列。并发现将其导入转基因植株后，可明显改善转基因植株的抗盐性，而且这些性状可稳定遗传。本专利技术第一方面提供棉花的一个离子通道类蛋白NHX1-2的编码基因，其序列为SEQIDNO：2。本专利技术第二方面提供一种重组表达载体，其含有本专利技术第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为附图2所示的35S-GhNHX1-2-2300载体。本专利技术第三方面提供一种重组细胞，其含有本专利技术第一方面所述的基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。本专利技术第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法，包括：将本专利技术第一方面所述基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。本专利技术第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本专利技术第一方面所述基因、本专利技术第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。本专利技术第六方面提供本专利技术第一方面所述的基因、本专利技术第二方面所述的重组表达载体或者本专利技术第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。本专利技术第七方面提供专利技术第一方面所述的基因编码的氨基酸序列，如SEQIDNO：1所示。附图说明图1是GhNHX1-2的植物表达载体(35S-GhNHX1-2-2300)的构建流程。图2是GhNHX1-2的植物表达载体(35S-GhNHX1-2-2300)的质粒图。图3是GhNHX1-2转基因T1代烟草植株(图右，T1Y2)和作为对照的非转基因烟草植株(图左)的耐盐模拟实验结果。图4是GhNHX1-2转基因T1代烟草植株和非转基因对照植株在转录水平上的蛋白表达验证结果。M为Marker，1-8为正常生长转基因植株，9-12为对照植株，13为正对照(GhNHX1-2)。具体实施方式下面结合非限制性实施例对本专利技术进行进一步说明。实施例1盐胁迫下棉花SSH文库构建：具体方法为：利用Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以经NaCl处理6h的棉花幼苗的根的mRNA作为样品(tester)，以未处理的棉花幼苗的根的mRNA作为对照(driver)。(1)供试材料：非洲棉(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-06838)播种到灭过菌的蛭石上，在25℃、光暗周期16h/8h条件下培养，每周浇1/2MS培养基(9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。当苗株长高达25-30cm时用于实验。(2)材料处理：将供试幼苗分为2组，每组4株。第一组为对照组，在25℃、光照下培养，放置到1/2MS液体培养基中。第二组为处理组，25℃、光照下培养，放置到添加有终浓度为200mMNaCl的1/2MS液体培养基中，处理6小时，处理完毕后及时剪取两组幼苗的根，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。(3)总RNA提取：分别取对照和NaCl处理的棉花根0.5g，用植物RNA提取试剂盒(invitrogen)提取棉花的总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA纯化试剂盒(purificationofpolyA+RNAfromtotalRNA)分离mRNA。(4)抑制消减杂交：按Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒所示的方法进行抑制差减杂交。应用Clontech的PCR-SelectcDNASubtractionKits差减杂交试剂盒，先将Driver和Tester的mRNA分别反转录，得到双链cDNA，再以2μgTester和2μgDrivercDNA作为起始材料进行差减杂交。在37℃水浴下分别将TestercDNA和D本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.棉花的一个离子通道类蛋白编码基因，其序列为SEQIDNO:2。2.一种重组表达载体，其含有权利要求1所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。3.权利要求2所述的载体，其为附图2所示的35S-GhNHXl-2-2300载体。4.一种重组农杆菌细胞，其含有权利要求1所述的基因或者权利要求2或3所述的重组表达载体。5.一种改善植物耐盐性的方法，包括：将权利要求1所述的基因或者权利要求2或所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达。...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔洪志，王建胜，田大翠，李晓霞，陈淼，
申请(专利权)人：创世纪种业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44