本发明专利技术公开了一种固载甲基转移酶电极传感器的制备方法，其特征是：（1）将预处理的铂盘电极采用电化学聚合法制备聚3-噻吩乙酸膜电极；（2）然后将聚3-噻吩乙酸膜电极氨基化；（3）再将氨基化的聚3-噻吩乙酸膜电极交联方法固载甲基转移酶，得到固载甲基转移酶电极传感器。用该电极快速检测样品中SAM，该方法灵敏度高、选择性好、响应时间短、干扰少，优于其它检测方法，是一种简单快速、方便易行的SAM测定方法，本申请制备的固载甲基转移酶电极传感器成本低、特异性好，具有实现自动化现场测定的潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种酶电极传感器的制备方法及快速检测应用
，特别涉及一种固载甲基转移酶电极传感器的制备方法，用于检测药品、生物样品中的S-腺苷甲硫氨酸技术。
技术介绍
酶电极分析方法是将酶蛋白分子采用传统的吸附法、包埋法、共价键合法、交联法作用固定化制成固定化酶膜，再与电化学基础电极相结合，构成酶电极生物传感器用于特异底物分析的一项生物技术。由于酶的高度专一性，该方法具有专一性高、稳定性好、检测速度快、选择性好、灵敏度高等特点。酶电极研宄起步于20世纪60年代，自2000年以来，生物传感器技术在环境检测、食品安全、军事和医学等方面的应用日益广泛，在申请号为201410210210.3的专利中公开了检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用；在授权公告号为CN102435650 B的专利中公开了一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法；在授权公告号为CN102495115 B的专利中公开了利用生物酶电极法检测根系分泌物中苹果酸的电化学方法。细胞内的甲基化反应存在通用甲基供体一S-腺苷甲硫氨酸(S-AdenosyImeth1nine，AdoMet，SAM)，SAM含有活性甲基，细胞内几乎所有用于甲基化修饰的甲基都来自SAM甲硫高能键。由于甲基化反应的广泛性，可以说，SAM是细胞内参加反应的重要性仅次于ATP的一种辅酶，细胞内SAM浓度的微小改变，便会对细胞的生长、分化和功能产生重大影响。SAM在细菌体内主要是由SAM合成酶(MetK)通过甲硫氨酸(Met)和ATP来合成。当E.的SAM合成酶水平下降，造成细胞内甲基供体SAM缺乏时，细胞就不会正常分裂。如果将来自T3噬菌体的AdoMet水解酶基因导入E.菌体细胞，使胞内SAM水平下降时，大肠埃希氏菌也形成了不分裂的长丝状菌体。进一步研宄表明，丝状菌体中，引发疋细胞分裂的Z环复合体装配可以正常起始，但不会完成，而当亮氨酸调节的SAM合成酶水平恢复正常，细胞内甲基供体SAM不再缺乏时，细胞分裂也随即恢复正常。很明显，细菌细胞的生长分裂与胞内SAM浓度是密切相关的。通用甲基供体SAM受甲基转移酶催化去甲基后，生成的通用产物是S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocystein，SAH), SAH被发现对胞内蛋白质和核酸的甲基化过程具有普遍的反馈抑制作用，是转甲基化反应的有效竞争性抑制剂。在哺乳动物细胞内，SAH通过SAH水解酶(SAH hydrolase, SAHH)催化水解生成腺苷酸和高半胱氨酸(Parveen, N.;Cornell, K.A..Me thyIth1adenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase, acritical enzyme for bacterial metabolism.Mol Microb1l, 20117,9(I):7_20，)，而在大多数病原微生物的细胞内，SAH的代谢则采用完全不同的方式一一通过S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocystein nucleosidase, SAHN)催化裂解生成腺嘌呤和S-核糖基高半胱氨酸，SRH进一步在S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的作用下生成高半胱氨酸和 4，5 二轻-2, 3-乙酰基丙酮(4，5-dihydroxy-2, 3-pentaned1ne，DPD),高半胱氨酸最后通过几种甲硫氨酸合成酶(MetH、MetE)重新生成SAM的前体一一甲硫氨酸，或者经过多步酶催化生成半胱氨酸。目前，已报道的测定SAM的方法有高效液相色谱法(HPLC)，该方法存在色谱柱容易污染，分析价格昂贵的缺陷，分光光度法，谷劲松等研宄S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲级转移酶活性的检测方法(谷劲松等，一种S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲级转移酶活性的检测方法，高等学校化学学报，2012，33(3):521~525)，该方法是依赖甲基转移酶、S-腺苷高半胱氨酸核苷酶和S-核糖基高半胱氨酸酶的催化作用将SAM分解为高半胱氨酸，再对高半胱氨酸显色反应，操作比较繁琐，准确度也不理想。由于样品的基质比较复杂，给检测带来了困难。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研宄人员、生产企业、质控人员、进出口商检、政府管理部门等的迫切需要的，对食品、药品、环境安全、生物样品中的SAM含量准确定量测定十分必要，对于SAM生产和药理研宄也具有十分重要的意义。生物酶电极传感器是当前开发具有专一性、稳定性、检测速度快、选择性好、灵敏度高等特点，广泛用于医药临床、食品、环境及生物样品检测领域，而将甲基转移酶固载在电极上用于SAM的检测未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是将甲基转移酶固载铂电极上与电化学相结合，提供了一种固载甲基转移酶传感器的制备方法，并应用检测SAM中，采用电聚合法在铂电极表面电聚合聚(3-噻吩乙酸)制备聚(3-噻吩乙酸)电极，然后将聚3-噻吩乙酸电极氨基化，再将甲基转移酶固载在氨基化的电极上，制备得甲基转移酶电极传感器。仪器与试剂 CHI660B电化学工作站(上海辰华仪器公司)，电聚合体系:工作电极是直径为3 mm的铂盘电极，对电极、参比电极均使用直径为0.5 mm的Pt丝；实验采用三电极体系:铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极(SCE)，酶电极(GCE)为工作电极；KQ_250E型超声波清洗器(坤峰超声仪器有限公司)。3-噻吩乙酸，三氟化硼乙醚(BFEE)，N-甲基吡咯烷酮，氯化亚砜，N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，乙二胺，甲醇，戊二醛，甲基转移酶(E.C.2.1.1.3)，DNA, SAM ;硫酸，磷酸盐缓冲溶液，所用试剂均为分析纯，水为高纯水。本专利技术的目的通过如下技术方案实现。一种固载甲基转移酶电极传感器的制备方法，特征在于该方法具有以下工艺步骤: (1)铂电极预处理:将直径为3mm的铂盘电极，对电极、参比电极均使用直径为0.5 mm的Pt丝依次用1.0 Mm、0.3 Mm、0.05 Mm的Al2O3泥浆抛光打磨成镜面，并在超声清洗仪中先后用乙醇、水超声清洗5 min，以清洗后的铂盘电极做为工作电极，于1.0 mol L—1的硫酸溶液中以0.1 V s—1的速度从-0.2到+1.5 V电位范围内进行循环伏安扫描至稳定，得到预处理铂电极； (2)聚3-噻吩乙酸膜电极制备:将含有3-噻吩乙酸的质量百分浓度为35~45%的N-甲基吡咯烷酮溶液通入氮气除氧15~20min除氧后，加入0.5-1.0 mL三氟化硼乙醚作为电解质，将预处理电极放入，采用计时电流法在电压为1.4 V，时间为70-90 s的条件下合成3-噻吩乙酸膜电极，将合成的聚合膜在80 °C的真空干燥箱中干燥12小时以除去电极上的溶剂，得到聚3-噻吩乙酸膜电极； (3)氨基化聚3-噻吩乙酸膜电极制备:在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，氯化亚砜:60~75%，N, N- 二甲基甲酰胺:5~12%，混合均勾，将聚3-噻吩乙酸膜电极放入，室温反应24~30h，温度升到55~60°C恒温反应4~5 h，滴加乙二胺:18~30%，再于55~60°C恒温反应2~3 h，取出电极，用N，N- 二甲基甲酰胺洗涤，于本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固载甲基转移酶电极传感器的制备方法，特征在于，该方法具有以下工艺步骤：（1）铂电极预处理：将直径为3 mm的铂盘电极，对电极、参比电极均使用直径为0.5 mm的Pt丝依次用1.0 µm 、0.3 µm 、0.05 µm的Al2O3泥浆抛光打磨成镜面，并在超声清洗仪中先后用乙醇、水超声清洗5 min，以清洗后的铂盘电极做为工作电极，于1.0 mol L‑1的硫酸溶液中以 0.1 V s‑1 的速度从‑0.2到+1.5 V电位范围内进行循环伏安扫描至稳定，得到预处理铂电极；（2）聚3‑噻吩乙酸膜电极制备：将含有3‑噻吩乙酸的质量百分浓度为35~45%的 N‑甲基吡咯烷酮溶液通入氮气除氧15~20min除氧后，加入0.5~1.0 mL三氟化硼乙醚作为电解质，将预处理电极放入，采用计时电流法在电压为1.4 V，时间为70‑90 s 的条件下合成3‑噻吩乙酸膜电极，将合成的聚合膜在80 ℃的真空干燥箱中干燥12小时以除去电极上的溶剂，得到聚3‑噻吩乙酸膜电极；（3）氨基化聚3‑噻吩乙酸膜电极制备：在反应器中，按如下组成的质量百分浓度加入，氯化亚砜：60~75%，N,N‑二甲基甲酰胺：5~12%，混合均匀，将聚3‑噻吩乙酸膜电极放入，室温反应24~30h，温度升到55~60℃恒温反应4~5 h，滴加乙二胺：18~30%，再于55~60℃恒温反应2~3 h，取出电极，用N,N‑二甲基甲酰胺洗涤，于60℃干燥，放入质量百分浓度为12%的戊二醛溶液中，超声50~60min，取出干燥，得到氨基化聚3‑噻吩乙酸膜电极；（4）甲基转移酶固定液的制备：在反应器中，按甲基转移酶与DNA质量比为1：1加入，甲基转移酶与DNA溶解在pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液中，溶液中含甲基转移酶与DNA的浓度都在12~15mg/mL范围内，该溶液为甲基转移酶固定液；（5）固载甲基转移酶电极传感器的制备方法：取步骤（4）制备的甲基转移酶固定液滴涂到步骤（3）制备的氨基化聚3‑噻吩乙酸膜电极上，滴涂的量为22~30μL，在5~8℃干燥，即得固载甲基转移酶电极传感器。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李慧芝，李志英，杨春霞，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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