肾癌舒尼替尼耐药细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，具体涉及肾癌舒尼替尼耐药的细胞系及其构建方法与应用。本发明专利技术采用人肾透明细胞癌细胞系786-O细胞与ACHN细胞为对象建立皮下荷瘤裸鼠模型，利用临床常规剂量的舒尼替尼治疗荷瘤裸鼠，并通过体内连续传代多次药物压力筛选，最后分离培养获得了在体内外均不受舒尼替尼抑制的肾癌耐药细胞系，命名为7SuR、ACSuR。本发明专利技术建立的肾癌舒尼替尼耐药的细胞系更能模拟临床药物耐药，为研究肾癌靶向药物耐药机制、逆转肾癌细胞耐药性以及开发和评价新的抗癌药物提供了重要的平台。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及生物医学
，具体设及肾癌舒巧替巧耐药细胞系及其构建方法 与应用。
技术介绍
肾癌约占成人恶性肿瘤的3%，在中国的发病率位居泌尿系肿瘤第二位。其主要病 理类型为透明细胞癌，大约30%的患者在诊断时即发现远处转移，术后远处转移的发生率 也高达30%~40%。由于肾癌对传统的放、化疗不敏感，W白介素-2、干扰素-a等为基础 的细胞因子治疗一度成为晚期肾癌的主要治疗手段，但也仅在不到20%的患者中起效，且 有明显的副作用。 近年来出现的W舒巧替巧为代表的小分子祀向药物极大改善了晚期肾癌的治疗 前景，其中位无进展生存期是接受细胞因子治疗患者的两倍，总缓解率相比也有显著的提 高。舒巧替巧（Sunitinib，Sutent，索坦）是一种小分子多祀点受体酪氨酸激酶（RTK) 抑制剂，它能够抑制血管内皮生长因子受体-1/2 (VEGFR-1/2)，血小板源性生长因子受体 (PDGFR)、集落刺激因子受体-1 (CSF-1R)、干细胞生长因子受体（C-KIT)、FMS样的酪氨酸激 酶3 (化T3)，具有抗血管生成和抗肿瘤活性的双重作用，是肾癌治疗中最常用的小分子祀向 药物。 尽管祀向药物能够显著缩减肿瘤体积并延长晚期肾细胞癌患者中位无进展生存 期和总生存期，却不能保持持久疗效，多数患者会在治疗开始的5-10月出现耐药甚至进 展，因此研究肾癌耐药机制W及防止或逆转肿瘤耐药的发生对于提高祀向治疗效果十分重 要，但目前尚缺乏对舒巧替巧耐药的肾癌细胞系，肿瘤耐药细胞系的构建方法也亟待摸索 和改进。 而肾癌耐药细胞系的建立对于研究肾癌细胞耐药机制、逆转肾癌细胞耐药性和指 导病人用药方面都具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供肾癌舒巧替巧耐药细胞系，本专利技术的另一目的是提供该肾 癌舒巧替巧耐药细胞系的构建方法W及应用。 本专利技术的主要技术方案是采用人肾癌细胞系786-0与ACHN细胞为对象建立皮下 荷瘤裸鼠模型，利用临床常规剂量的舒巧替巧治疗荷瘤裸鼠，并通过体内连续传代多次药 物压力筛选，最后分离培养获得了在体内外均不受舒巧替巧抑制的肾癌耐药细胞系7SuR、 ACSuRo[000引本专利技术提供了一种肾癌舒巧替巧耐药细胞系，该肾癌舒巧替巧耐药细胞系的保藏 编号为CCTCCC2014217 或CCTCCC2014238。 本专利技术的肾癌舒巧替巧耐药细胞系，命名为人源性肾透明细胞癌细胞舒巧替巧 耐药株7SuR(肾癌耐药细胞系7SuR，简称7SuR)，保藏于中国典型培养物保藏中屯、（简称 CCTCC)，保藏日期2014年12月9日，保藏编号CCTCCC2014217。 本专利技术的肾癌舒巧替巧耐药细胞系，命名为人源性肾透明细胞癌细胞舒巧替巧耐 药株ACSuR(肾癌耐药细胞系ACSuR，简称ACSuR)，保藏于中国典型培养物保藏中屯、（简称 CCTCC)，保藏日期2014年12月9日，保藏编号CCTCCC2014238。 本专利技术提供了上述的肾癌舒巧替巧耐药细胞系的构建方法，具体如下： 复苏人肾透明细胞癌细胞系786-0细胞与ACHN细胞后，用含10 %胎牛血清的 DMEM培养液，于37°C，5%C〇2解箱中培养；收集处于对数生长期的人肾透明细胞癌细胞系 786-0细胞与ACHN细胞，W3Xl〇6/点，接种于裸鼠两侧肩肿部皮下，建立裸鼠肾癌模型； 待裸鼠移植瘤体积> 200mm3后，将裸鼠随机分为2组，分别为生理盐水组和舒巧 替巧组（40mg/kg，灌胃，1次/天，4周），停药2周后，从肿瘤组织中分离出肿瘤细胞，为第 1代； 将第1代肿瘤细胞3X1〇7点，再次皮下接种裸鼠，重复前次处理，得到第2代，重 复上述方法，最终从第3代移植瘤中分离出肾癌细胞系。 将祀向药物处理组与对照组的第3代肿瘤细胞进行体内外药敏实验，发现前者在 祀向药物常规剂量下出现明显的耐药抵抗（在裸鼠体内生长不受舒巧替巧抑制，在体外培 养耐受lOuM药物浓度），因此将舒巧替巧持续压力下获得的第3代及其之后代数的肿瘤细 胞作为舒巧替巧耐药的肾癌细胞系。 保藏于CCTCC的为第4代细胞。 本专利技术还提供了两种根据上述构建方法获得的肾癌舒巧替巧耐药细胞系。 所述的肾癌舒巧替巧耐药细胞系，为舒巧替巧持续压力下获得的第3代及其之后 代数的肿瘤细胞，为舒巧替巧耐药的肾癌细胞系7SuR、舒巧替巧耐药的肾癌细胞系ACSuR。 本专利技术所述的耐药细胞系是利用临床常规剂量的舒巧替巧治疗786-0与ACHN荷 瘤裸鼠，并通过体内连续传代多次药物压力筛选，最后分离培养获得的。 本专利技术所述的耐药细胞系在裸鼠体内生长不受舒巧替巧抑制，在体外培养耐受 lOuM药物浓度。 本专利技术通过细胞形态学观察、生长曲线及IC50测定、细胞周期的测定、软琼脂克 隆形成实验和裸鼠荷瘤实验等，检测肾癌耐药细胞系的生物学特性，从而确定肾癌耐药细 胞系7SuR、ACSuR的成功建立。 本专利技术还提供了肾癌舒巧替巧耐药细胞系在研究肾癌细胞耐药机制中的应用，可 通过药物敏感与耐药细胞之间的基因组、表达谱、信号通路活化情况等方面的对比分析，探 寻可能导致药物耐药的罪魅祸首。 本专利技术还提供了肾癌舒巧替巧耐药细胞系在筛选和制备抗肾癌药物中的应用，可 利用小分子化合物库，探寻能够逆转舒巧替巧耐药的小分子祀向药物，并在小鼠体内进行 临床前期的联合应用治疗。 本专利技术可用于分析肾癌发生舒巧替巧耐药后的形态学及生物学表型的变化；研究 肿瘤对舒巧替巧耐药的分子机制和逆转肿瘤耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物；发现肿瘤 耐药标志物W及筛选和评估新型抗肿瘤药物、单克隆抗体药物等，具有较高的科研和生产 应用价值。【附图说明】 图1是建立舒巧替巧耐药小鼠肾癌模型示意图； 图2是光学显微镜下对照和耐药细胞的细胞形态； 图3是对照和耐药细胞的生长曲线图和药物浓度-抑制率曲线，其中A为786-0 细胞及其耐药细胞7SuR，B为ACHN细胞及其耐药细胞ACSuR; 图4是对照和耐药细胞周期图，其中A为786-0细胞及其耐药细胞7SuR，B为ACHN 细胞及其耐药细胞ACSuR; 图5是对照和耐药细胞的平板克隆实验图，其中A为786-0细胞及其耐药细胞 7SuR，B为ACHN细胞及其耐药细胞ACSuR; 图6是对照和耐药细胞的软琼脂克隆形成实验图，其中A为786-0细胞及其耐药 细胞7SuR，B为ACHN细胞及其耐药细胞ACSuR; 图7是对照和耐药细胞在裸鼠体内的生长曲线图，其中A为786-0细胞及其耐药 细胞7SuR，B为ACHN细胞及其耐药细胞ACSuR。 本专利技术的肾癌舒巧替巧耐药细胞系，命名为人源性肾透明细胞癌细胞舒巧替巧耐 药株7SuR，保藏于中国典型培养物保藏中屯、（简称CCTCC)，保藏单位地址；中国武汉武汉 大学，保藏日期2014年12月9日，保藏编号CCTCCN0;C2014217。 本专利技术的肾癌舒巧替巧耐药细胞系，命名为人源性肾透明细胞癌细胞舒巧替巧耐 药株ACSuR,保藏于中国典型培养物保藏中屯、（简称CCTCC)，保藏单位地址：中国武汉武 汉大学，保藏日期2014年12月9日，保藏编号CCTCCNO;C2014238。【具体实施方式】 下面结合附图和具体实施例对本专利技术作详细描述，但本专利技术的实施不仅限本文档来自技高网...

【技术保护点】
肾癌舒尼替尼耐药细胞系，其保藏编号为CCTCC C2014217或CCTCC C2014238。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：曲乐，王林辉，刘冰，陈程，吴震杰，张雯，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31