一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法，首先将高碘酸钠粉末溶于去离子水中，制得高碘酸钠水溶液，然后搅拌海藻酸钠水溶液与高碘酸钠水溶液形成混合液使其进行氧化反应后加入乙二醇终止反应，抽滤混合液并用无水乙醇脱水沉淀后低温真空干燥制得氧化海藻酸钠粗品，再用蒸馏水溶解成氧化海藻酸钠粗品水溶液，将其透析完全后进行离心取上清液冷冻干燥制得氧化海藻酸钠，最后将羟乙基壳聚糖与氧化海藻酸钠混合经双联注射器交联反应挤推至试管中得羟乙基壳聚糖原位水凝胶，用于角膜缘干细胞的快速包封移植；其制备工艺简单，原理安全可靠，制备成本低，产品质量好，使用安全，卫生，治疗环境友好。

【技术实现步骤摘要】

： 本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方 法。
技术介绍
： 角膜位于眼球最外层，受伤概率极高，易导致不同程度的瘢痕，影响视力，角膜损 伤种类繁多，其中化学损伤在临床上治疗难度较大，由于化学物质能对眼组织结构造成严 重损伤，导致上皮坏死、脱落，角结膜融解穿孔及睑球粘连等，预后较差；目前临床上主要以 羊膜移植或角膜移植来治疗，但前者常常发生羊膜自溶，后者又面临供体缺乏和免疫排斥 两大问题，所以角膜缘干细胞移植治疗角膜损伤成为研宄的热点。角膜碱烧伤后，由于碱 的皂化作用，首先破坏角膜的最外层一上皮层，上皮损伤后角膜缘干细胞向中央移行，形成 覆盖创面的新上皮。一旦角膜缘损伤，角膜上皮再生来源缺乏，就会严重延迟角膜上皮的 修复，从而激发急性炎症反应；白细胞迅速侵入角膜，缺损区出现多形核白细胞（PMN)，PMN 释放大量的蛋白酶；其中的胶原酶溶解胶原纤维，而被激活的基质金属蛋白酶（MMPs)降解 角膜细胞外基质多种成分，致使角膜组织迅速崩解，形成溃疡；同时，暴露的角膜基质细胞 受刺激后，为了弥补溃疡面的缺损，从静止状态向修复表型的成纤维细胞、肌成纤维细胞转 化，使得细胞内部结构发生改变，光线通过时发生散射而致透明度下降；而且成肌纤维细胞 会产生大量的粗大且排列紊乱的胶原纤维，造成组织纤维化瘢痕的形成，严重影响视力的 恢复。所以，角膜严重损伤治疗必须从两方面着手，一是进行角膜缘干细胞移植，为角膜上 皮及时修复提供种子细胞；二是防止角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化，抑制瘢痕的形成。 近年来，为了解决角膜缺损后的干细胞来源问题，研宄者尝试在体外培养自体或同种异体 培养角膜缘干细胞（LSCs)用于角膜移植；体外培养的角膜缘干细胞具有诸多优点：1、所 需角膜缘组织极少，对供眼无潜在威胁；2、培养的细胞可冻存用于二次移植；3、能抑制眼 表急性病变的发展，迅速恢复术眼正常的眼表结构；4、可避免异体组织移植而导致的免疫 排斥；5、缓解角膜供体来源不足的难题。但角膜缘干细胞移植必须借助一种安全可靠的载 体，这是决定该技术应用效果的关键环节，若载体适宜，角膜缘干细胞移植将为角膜损伤患 者带来新的福音；目前，临床上应用较多的载体是羊膜，因其作为一种基底膜，具有类似角、 结膜的成分，即IV型胶原纤维，但严重角膜损伤如碱烧伤后，组织中胶原酶的表达量大大增 加，易导致羊膜自溶，直接延缓修复过程；因此患者即使多次移植，效果仍不理想，探寻一种 安全有效的角膜缘干细胞移植载体成为当前研宄的热点。 在现有技术中，水溶性的羟乙基壳聚糖（HECTS)是壳聚糖的一种重要衍生物，其 在生物体内可被生物酶催化，缓慢降解成对人体无毒的单糖，与细胞外基质成分相似，支持 细胞的粘附和生长；同时能够抑制成纤维细胞生长，降低创面转化生长因子(TGF-β ) 表达水平，从而具有防粘连的作用；海藻酸钠（SA)是从海藻中提取的天然聚阴离子多糖， 具有良好的成胶性、生物相容性和低毒性以及相对低廉的价格，被广泛地应用在轻工业、食 品、组织工程和医药等领域，SA具有聚阴离子羧基，可与二价离子形成离子交联型水凝胶， 常用作酶类、蛋白质、药物及动植物细胞的包埋固定化载体，但由于二价离子很容易与周围 介质中的离子发生交换，导致凝胶的降解速度不可控。
技术实现思路
： 本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种羟乙基壳聚糖原位水 凝胶的制备方法，以角膜碱烧伤为研宄模型，针对角膜损伤修复制备能够在角膜损伤原位 自主交联快速形成凝胶的新型角膜缘干细胞移植载体。 为了实现上述目的，本专利技术涉及的羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备工艺包括高碘 酸钠水溶液制备、氧化海藻酸钠制备和羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备三个步骤： (1)、高碘酸钠水溶液制备：常温下称取高碘酸钠（Sigma，S1878)粉末Ig并溶于 50ml去离子水中，制得质量百分比浓度为2%的高碘酸钠水溶液； (2)、氧化海藻酸钠制备：在质量百分比浓度为2%的海藻酸钠水溶液中按海藻酸 钠与高碘酸钠反应的摩尔比为10:1加入步骤（1)制备的高碘酸钠水溶液，在室温下搅拌 海藻酸钠水溶液和高碘酸钠水溶液混合形成的混合液使其进行氧化反应，24h后在混合液 中加入乙二醇IOOul终止氧化反应0. 5h，抽滤混合液并用无水乙醇脱水沉淀得到白色固形 物，低温真空干燥白色固形物后制得氧化海藻酸钠粗品，再将氧化海藻酸钠粗品用蒸馏水 溶解成质量百分比浓度为2%的氧化海藻酸钠粗品水溶液，在4°C温度下将氧化海藻酸钠 粗品水溶液置于透析袋中透析，每6h换1次蒸馏水，用电导率仪测定氧化海藻酸钠粗品水 溶液透析完全后进行离心后取上清液冷冻干燥制得氧化度为10 %的氧化海藻酸钠； (3)、羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备：将质量百分比浓度为2%羟乙基壳聚糖与步 骤（2)制得的氧化海藻酸钠按质量比8:1等体积混合后经过双联注射器交联反应挤推至试 管中得羟乙基壳聚糖原位水凝胶。 本专利技术所述高碘酸钠为强氧化剂，能氧化邻二醇结构，使其成为醛或酮；海藻酸 钠的糖醛酸单元具有顺式邻二醇结构，能在高碘酸钠的氧化作用下打开C-C键生成两个醛 基，海藻酸钠的氧化机理如图1所示，海藻酸钠通过氧化引入醛基制备得到的氧化海藻酸 钠，直接与带有游离氨基的羟乙基壳聚糖发生交联反应在创面快速形成原位水凝胶，作为 角膜缘干细胞移植载体，促进角膜上皮重建。 本专利技术与现有技术相比，利用海藻酸钠具有顺二醇结构的性质，将其适度氧化引 入一定量的醛基，制备成氧化海藻酸钠，使其能直接与带有游离氨基的多糖发生交联反应， 氧化海藻酸钠与羟乙基壳聚糖直接交联形成原位水凝胶，作为角膜缘干细胞移植的载体并 将其用于角膜眼表严重损伤的修复，既无交联剂的添加，生物安全性高，又可达到与损伤角 膜高度吻合；利用羟乙基壳聚糖原位水凝胶快速原位成胶的特性，将体外培养的角膜缘干 细胞与羟乙基壳聚糖混合后，与氧化海藻酸钠经双联注射器交联成胶，将角膜缘干细胞包 封于眼表创面治疗严重角膜损伤，羟乙基壳聚糖原位水凝胶与眼表曲率吻合度更高，克服 了膜片无法实现理想曲率的缺点，羟乙基壳聚糖原位水凝胶-角膜缘干细胞能够明显促进 角膜上皮重建，有效防止角膜瘢痕化；通过慢病毒感染体外培养的角膜缘干细胞，筛选出稳 定表达荧光素酶的干细胞用于活体示踪，来揭示角膜缘干细胞参与修复的动态过程；其制 备工艺简单，原理安全可靠，制备成本低，产品质量好，使用安全，卫生，治疗环境友好。【附图说明】： 图1是本专利技术涉及的海藻酸钠的氧化机理示意图。 图2是本专利技术涉及的兔角膜缘干细胞体外培养图及细胞免疫化学染色结果 (100 X )，（a)角膜缘干细胞原代培养；(b)角膜缘干细胞传代培养；(c) Λ Np63细胞免疫化 学染色；（d)角蛋白K3细胞免疫化学染色。 图3是本专利技术涉及的转化生长因子-β/Smad通路相关因子基因及蛋白水平的检 测，A:Real-time PCR结果（*P〈0.05) ;B:Western blot结果；C-D:相关因子蛋白水平的比 较。【具体实施方式】： 下面通过实施例并结合附图对本专利技术做进一步描述。 实施例： 本实施例涉及的羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备工艺包括高碘酸钠水溶液制备、 氧化海藻酸钠制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法，其特征在于制备工艺包括高碘酸钠水溶液制备、氧化海藻酸钠制备和羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备三个步骤：(1)、高碘酸钠水溶液制备：常温下称取高碘酸钠粉末1g并溶于50ml去离子水中，制得质量百分比浓度为2％的高碘酸钠水溶液；(2)、氧化海藻酸钠制备：在质量百分比浓度为2％的海藻酸钠水溶液中按海藻酸钠与高碘酸钠反应的摩尔比为10:1加入步骤(1)制备的高碘酸钠水溶液，在室温下搅拌海藻酸钠水溶液和高碘酸钠水溶液混合形成的混合液使其进行氧化反应，24h后在混合液中加入乙二醇100ul终止氧化反应0.5h，抽滤混合液并用无水乙醇脱水沉淀得到白色固形物，低温真空干燥白色固形物后制得氧化海藻酸钠粗品，再将氧化海藻酸钠粗品用蒸馏水溶解成质量百分比浓度为2％的氧化海藻酸钠粗品水溶液，在4℃温度下将氧化海藻酸钠粗品水溶液置于透析袋中透析，每6h换1次蒸馏水，用电导率仪测定氧化海藻酸钠粗品水溶液透析完全后进行离心后取上清液冷冻干燥制得氧化度为10％的氧化海藻酸钠；(3)、羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备：将质量百分比浓度为2％羟乙基壳聚糖与步骤(2)制得的氧化海藻酸钠按质量比8:1等体积混合后经过双联注射器交联反应挤推至试管中得羟乙基壳聚糖原位水凝胶。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐文华，梁晔，管洪在，常志尚，王元松，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37