本发明专利技术研发出适宜于实时荧光PCR反应高特异性扩增HLA‑B*13:01等位基因的特异性引物探针组合，主要包括：F1：5’‑GGGCCAGGGTCTCACATCA ‑3’R1：5’‑GAGCCACTCCACGCAGTC‑3’F2：5’‑ACAGGGGCTAACGCAGA‑3’R2：5’‑CAACACCACAAC CATCAAG‑3’Probe1：5’‑HEX‑AGGATGTATGGCT GCGACCTGG‑BHQ2‑3’Probe2：5’‑CY5‑ATACATCCGT GCTTCATTGTCAC‑BHQ2‑3’；并基于此提供了一种快速、简便、高通量、高特异性检测该等位基因的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物基因分析领域，具体涉及一种针对HLA-B*13:01等位基因的特异 性引物及探针设计，以及检测方法。
技术介绍
麻风病是一种由分歧杆菌引起的一种慢性的具有较低传染性的疾病。主要累及皮 肤及外周神经，严重者可致容貌毁损和肢体畸残。世界卫生组织曾提出在上世纪末全球消 灭麻风的宏伟计划，虽然取得了相当显著的成绩，但至今麻风仍是一个重要的公共健康问 题。麻风在世界上流行已接近3000年，印度、埃及和中国被认为是世界三大麻风疫源地。在 我国，麻风已经流行了两千多年，20世纪40年代初应用砜类药物治疗麻风证明有效后，使 麻风的治疗进入了化学治疗的年代，在几十年的临床实践中，又相继发现了数种有效的抗 麻风药物。过去曾用单一药物治疗，疗期很长，后来陆续发现有耐药病例出现，而且耐药发 生率在不断增加，说明单一药物治疗麻风病不够理想。因此，世界卫生组织根据结核病化疗 的经验和马耳他采用多种药物联合化疗治疗麻风病的经验，于1982年推荐用MDT方案治疗 麻风病，使麻风病的治疗又发展到一个一个新的阶段，即从单一药物治疗转入多种药物化 疗，使麻风病的治疗期缩短了不少。联合化疗的药物通用的有3种，即氨苯砜、利福平和氯 法齐明。但是，据报道有大约2%的麻风患者在服用氨苯砜后会出现药物不良反应，其中致 死率高达12.5%。通常在临床上诊断氨苯砜过敏综合征（DIHR)的标准有发热、皮瘆、淋巴 结病和肝炎，氨苯砜过敏综合征通常还伴随着低血红蛋白症、胆汁阻塞及肝功能疾病。 人类主要组织相容性复合体（HLA)，是迄今为止人类多态性最高的区域之一，HLA 定位于人类第6号染色体的短臂6p21. 3,是一群紧密连锁的复等位基因群。包括220多个 基因，总长度达到3600kb，约占人类基因组总长度的1/3000。HLA在人类的免疫调节中起着 非常重要的作用。其中，I类基因（HLA-A，HLA-B，和HLA-C)以及II类基因（HLA-DR，HLA-DQ， 和HLA-DP)与抗原传递的调节有关，并且在免疫系统的肽呈递上起着重要的作用。1973 年，Brewerton等人研宄结果表明HLA-B*27与强直性脊柱炎的发生有明显的统计学关联。 2004年Chung等的研宄发现了HLA-B*15:02与卡马西平用药所引起的史蒂文森-综合征有 关。越来越多的结果表明HLA等位基因和一些药物引发的过敏性炎症有关，并且在2012年 Nicholas等的研宄表明HLA-B*13:01与氨苯砜用药所引起的氨苯砜过敏综合征（DIHR)有 明显的统计学关联。因此，在对病人进行氨苯砜用药之前进行HLA-B*13:01等位基因的筛 查是非常有意义的。 目前，HLA等位基因分型检测的常用方法主要是基于核酸序列识别的方法，主要包 括PCR-SBT(基于测序分型的聚合酶链反应），PCR-SS0P(序列特异性寡核苷酸探针分型） 和PCR-SSP(序列特异性引导的聚合酶链式反应）。 其中PCR-SBT法是对于HLA等位基因进行测序，从而确定具体的HLA等位基因亚 型，但其检测的操作繁琐、耗时长、成本高昂，而且测序结果会出现套峰，不适合对于临床样 本的快速指导。PCR-SSP技术则需要进行凝胶电泳实验、PCR后处理，因此该技术在操作过 程中易造成二次污染、时间长，同时在PCR过程中多对引物易造成二聚体等非目的基因产 物，从而造成假阳性结果。目前基于RT-PCR方法检测HLA-B*13:01等位基因的试剂盒较少， 而且操作繁琐，要多管反应，容易出现假阳性和污染，远远不能满足快速、简便、高特异性检 测HLA-B*13:01等位基因的需求。 目前已知HLA-B等位基因的亚型已达到3600多种，基于HLA等位基因的多态性， 在设计HLA-B*13:01等位基因特异性引物和探针之前，必须将HLA-B*13:01等位基因序列 与HLA-B其他等位基因序列进行比对，其中将HLA-B*07:02:01等位基因作为基础序列参 照。根据序列比对结果，发现HLA-B*13:01与多个HLA-B等位基因都具有很高的同源性，尤 其是HLA-B* 13系列的等位基因，而这些针对HLA-B* 13:01等位基因特异性的位点分布在多 个外显子和内含子区域中。
技术实现思路
本专利技术研发出两套适宜于实时荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*13:01等位基因 的引物和探针组合；在已有的实时定量PCR检测HLA等位基因的基础上，提供了一种更加快 速、简便、高通量、高特异性并且稳定检测HLA-B*13:01等位基因的方法。这样，能够为麻风 患者服用氨苯砜后出现严重皮肤不良反应的可能性的判断提供有意义的参考，有利于氨苯 砜的个体化用药。 本专利技术通过比对HLA-B的等位基因序列发现HLA-B*13:01相对于其他HLA-B等位 基因的特异性位点，主要在Intron2、Exon3和Intron5上。为了保证HLA_B*13:01等位基 因检测的特异性，至少需要设计两对特异性引物和探针，其中第一对特异性引物和探针分 布在内含子2和外显子3具有特异性位点的区域上，第二对特异性引物和探针分布在内含 子5具有特异性位点的区域上，将两对特异性的引物和探针放置在同一反应管中进行PCR 反应，最终扩增出来的HLA等位基因只有HLA-B*13:01。因此，检测待测样本时，当同时出现 第一对和第二对特异性引物、探针的扩增曲线时，说明此样本携带HLA-B*13:01等位基因。 本专利技术设计的HLA-B*13:01特异性的引物探针组合包括： 第一条上游引物F1 :5'-GGGCCAGGGTCTCACATCA-3'（序列 1)第一条下游引物R1 :5'-TCCTTGCCGTCGTAGGCT-3'（序列2) 探针Probel:5'-HEX-AGGATGTATGGCTGCGACCTGG-BHQ2-3'（序列 5) 其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein ;BHQ2为Black Hole Quencher-2〇第二条上游引物F2:5'-CACAGGGGCTAACGCAGA-3'（序列3)第二条下游引物R2 :5' -CCCAACACCACAACCATCAAG-3'（序列 4)探针Probe2 :5'-CY5-ATACATCCGTGCTTCAITGTCAC-BHQ2-3'（序列6) 其中CY5为：Cyaine5 一种检测HLA_B*13:01等位基因TaqMan探针实时荧光PCR法，主要包括以下环 T： (1)针对HLA_B*13:01特异性的引物和探针组合，即权利要求1所述的引物和探 针：并设计内参基因的引物和探针：⑵获得抽提的待测样本基因组DNA; (3)在同一个反应体系中将待测样本基因组DNA与HLA-B*13:01特异性的引物和 探针以及内参基因的引物和探针按一定的比例混合； (4)通过AppliedBiosystem7500 或者LightCyclerSystem480 进行实时焚光 PCR检测，其中分别利用FAM、HEX/VIC和CY5通道进行三通道荧光采集； (5)分析判断待测样本是否携带HLA-B*13:01等位基因。 基于以上方案，本专利技术还做了如下优化： 环节（1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于多重荧光PCR反应检测HLA‑B*13:01等位基因的特异性引物探针组合，其特征在于，包括以下引物和探针序列：第一条上游引物F1：5’‑GGGCCAGGGTCTCACATCA‑3’第一条下游引物R1：5’‑GAGCCACTCCACGCAGTC‑3’第二对上游引物F2：5’‑ACAGGGGCTAACGCAGA‑3’第二对下游引物R2：5’‑CAACACCACAACCATCAAG‑3’第一条探针Probe1：5’‑HEX‑AGGATGTATGGCTGCGACCTGG‑BHQ2‑3’第二条探针Probe2：5’‑CY5‑ATACATCCGTGCTTCATTGTCAC‑BHQ2‑3’其中，HEX为6‑carboxy‑hexachlorofluorescein；CY5为Cyaine5；BHQ2为Black Hole Quencher‑2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘正斌，王会娟，康星，韩敏，陈融，周少荷，陈超，
申请(专利权)人：陕西佰美基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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