本发明专利技术公开了一种利用微量核酸释放剂提取生物样本中病毒DNA的方法，属于分子生物学技术领域，特别是涉及利用微量核酸释放剂提取病毒核酸（DNA）的试剂及其使用方法；微量核酸释放剂裂解生物样本（血清或血浆）中病毒DNA同时，佐以促释放剂能更有效地保证裂解、释放效率；微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性；样本提取简便、灵敏、快速、准确，避免反复离心、洗脱开盖所引起的污染和核酸丢失，实现PCR提取的“一步法”和“一室化”操作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，特别是涉及利用微量核酸释放剂提取病毒核酸（DNA）的试剂及其使用方法。
技术介绍
核酸提取是下游核酸检测、研究或产品开发的起点，所分离的核酸的质量和完整性直接影响研究或诊断结果，因此核酸抽提是分子生物学最关键的方法之一，通常成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤：组织或细胞的破碎和裂解，核蛋白复合体的变性，核酸酶的灭活以及污染物的去除，理想的提取方法可以获取高质量的靶核酸，同时没有蛋白、糖脂和其它核酸污染，目前已有很多专业化的核酸抽提方法可以从各种生物样品中抽提DNA或者总核酸。目前核酸分离技术虽然发展迅速，但是均存在一些缺点，例如：酚氯仿抽提法虽然核酸纯度高，但是其主要成分对人体有害，且容易造成环境污染，同时提取过程需要反复抽提，多次换管，步骤繁琐，会造成样本的丢失与污染；碱裂解法：该法提取的核酸不容易保存；硅胶膜吸附柱法提取的核酸DNA浓度纯度低操作复杂；磁珠法因提取成本较高，从而限制了广泛应用；本试剂用于生物样本病毒DNA提取，样本需求量少、操作简便、无需繁琐的离心、洗脱等步骤，微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免反复离心、洗脱开盖所引起的污染和核酸丢失；实现PCR提取的“一步法”和“一室化”操作。
技术实现思路
本专利技术是提供一种微量核酸释放剂，它采用一步法操作完成血清、血浆中 DNA 的快速释放，获得的核酸适用于荧光定量 PCR 等下游检测，具有操作简便、使用安全、成本低廉的优点，适合在临床基因检测中推广应用。根据本专利技术的一个优选实施方案，试剂组分如下：微量核酸释放剂、促释放剂、封闭剂；微量核酸释放剂含有 5～500mM的 KCl、0. 5～20％ Triton X-100 、1～100mg/ml的蛋白酶K、1～20mM的NaOH；促释放剂含有pH值5～8的DMSO、终浓度0.5～10%的BSA。在优选的情况下，微量核酸释放剂配制方法为：在灭菌去离子水中加入KCl终浓度为5～500mM，终浓度0. 5～20％ Triton X-100 、终浓度1～100mg/ml的蛋白酶K、终浓度1～20mM的NaOH；促释放剂：在灭菌去离子水中加入终浓度10%，pH值5～8的DMSO、终浓度0.5～10%的BSA；质量或体积百分比以提取试剂体积为计算基准；配制的试剂长期保存需-20℃冻存。具体的，在一个优选的实施方案中，本专利技术所述方法包括如下步骤：1）取微量核酸释放剂5μl加入等体积的血清或血浆样本，用移液器吹打混匀10次；2）每管加入30μl的封闭剂；3）盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：第一步：95℃，10分钟；第二步：4℃，2分钟；4）将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，小心打开管盖，每管加入2.5μl促释放剂并用移液器反复吹打混匀10次。本专利技术的微量核酸释放剂采用蛋白变性剂，能快速破坏病毒颗粒外壳蛋白结构释放 DNA，与传统的热裂解方式结合同步进行，更有效的保证样本中核酸裂解效率，微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性；且微量核酸释放剂中含有抑制核酸酶的组分，对 PCR后续实验不会产生影响。附图说明图1为采用本专利技术的试剂提取的HBV血浆梯度稀释扩增结果。图2为采用本专利技术的试剂提取的HBV血浆精密度扩增结果。具体实施方式参照一下实施例可以对本专利技术作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本专利技术并不局限于这些实施例。实施例1：用本专利技术方法对乙肝病毒核酸血浆样本（HBV-DNA）梯度稀释进行提取；1）取已知浓度（2×107IU/ml）HBV阳性样本，用基质血清依次十倍稀释至200IU/ml备用；2）准备相应数量200μl无核酸酶PCR反应管，每管加入5μl微量核酸释放剂，加入5μl待检HBV样本（2×107IU/ml～200IU/ml六个浓度），用移液器反复吹打10次；3）加入30μl封闭剂；4）盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：第一步：95℃，10分钟；第二步：4℃，2分钟；5）将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，小心打开管盖，每管加入2.5μl促释放剂并用移液器反复吹打混匀10次；6）加入HBV反应液，设置HBV程序扩增。实施例2：用本专利技术方法对乙肝病毒核酸血浆样本（HBV-DNA）精密度进行提取；1）取已知浓度（2×107IU/ml）HBV阳性样本，用基质血清依次十倍稀释至2×103IU/ml备用；2）准备相应数量200μl无核酸酶PCR反应管，每管加入5μl微量核酸释放剂，加入5μl待检HBV样本（2×105IU/ml和2×103IU/ml两个浓度，每个浓度样本8个复孔），用移液器反复吹打10次；3）加入30μl封闭剂；4）盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：第一步：95℃，10分钟；第二步：4℃，2分钟；5）将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，小心打开管盖，每管加入2.5μl促释放剂并用移液器反复吹打混匀10次；6）加入HBV反应液，设置HBV程序扩增。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用微量核酸释放剂提取血清或血浆样本中病毒核酸（DNA）的方法。
【技术特征摘要】
1.一种利用微量核酸释放剂提取血清或血浆样本中病毒核酸（DNA）的方法。
2.该试剂含有核酸释放剂、促释放剂、封闭剂；核酸释放剂含有 KCl、Triton X-100 、蛋白酶K、NaOH；促释放剂含有DMSO、BSA；封闭剂中含有等体积的石蜡油和矿物油。
3.该技术采用微量核酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭冬冬，迟磊，吕翔，张美娜，杨海侠，
申请(专利权)人：宝瑞源生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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