本发明专利技术设计了适用于TaqMan探针实时荧光PCR法检测HLA-B*57:01基因型的特异性引物探针组合，即上游引物Fp：5’-AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3’，下游引物Rp：5’-TGAAACCGGGTAAACGCG-3’，探针Probe：5’-HEX-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC-BHQ2-3’；同时使用β-Globin做内参基因，将目的基因和内参基因的引物和探针加入同一反应体系进行双通道实时荧光PCR反应，通过扩增曲线分析结果。采用本发明专利技术设计的特异性引物探针组合以及检测方法，特异性和灵敏度高，同时具有操作简便、分辨率高、无污染、高通量等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物基因分析领域，针对HLA-B*57:01等位基因的特异性引物及探针 设计，以及检测方法。
技术介绍
主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC)是由一群紧 密连锁的基因群组成，是早期从组织器官移植实验中发现的，人类的MHC通常称为HLA基 因或HLA复合体，其编码的分子表达于白细胞上，称为人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA)。丰富的多态性是HLA基因系统的一个最重要特点，HLA复合体中的许多DNA 序列都存在变异体，称为等位基因。HLA基因系统的多态性保证了个体对各种病原体的免疫 应答。近年来临床药物基因组学研宄将阿巴卡韦（Abacavir，ABC)所致的超敏反应（HSR) 和HLA-B*57:01等位基因密切关联起来。在服用ABC的HSR患者中，HLA-B*57:01等位基因 的携带率为94. 4%，相比于未产生ABC HSR的患者，其HLA-B*57:01的携带率仅为11. 7%， 证明HLA-B*57:01与ABC HSR具有明显的统计学关联。 阿巴卡韦，是一种选择性艾滋病病毒I型（Human immunodeficiency virus I， HIV-1)和II型（HIV-2)抗病毒制剂，作为一种核苷类反转录酶抑制剂，，从1999年即作为 经典的联合用药中的一种药物，被欧美一些国家采用，目前仍是美国食品与药品管理局推 荐的初次服用的首选药物。但是据现有资料报道服用阿巴卡韦药物后，大约有5% -8%的 人会出现阿巴卡韦过敏反应（ABC HSR)。ABC HSR是一种多器官综合征，最常见的症状包括 发热（见于约80%的病例）、皮瘆（见于约70%的病例）、不适、疲劳、恶心、呕吐，其他还包 括：肌肉痛或关节痛、头痛、腹泻、瘙痒、低血压和各种呼吸系统症状。研宄表明94%的反应 出现在用药6周内发生，近50%患者有3-4个器官或系统受累表现，如果曾发生过ABC HSR， 再次用药后各种相关临床症状出现的几率远高于首次用药的反应。 2002年Mallal等研宄发现阿巴卡韦斑贴实验阳性者人群遗传的HLA-B*57:01单 体型基因频率更高。利用阿巴卡韦特异性的免疫学反应进行判断，结果发现临床诊断ABC HSR阴性组中斑贴实验阳性率为2. 7%，HLA-B*57:01试验阳性率为0%，HLA-B*57:01阴性 预测率为100%，证明基因筛查能排除免疫介导的类似ABCHSR，减少假阳性诊断。因此越来 越多的医师推荐在服用阿巴卡韦之前进行HLA-B*57:01基因检测，以降低阿巴卡韦引起的 不良反应。 目前常用HLA等位基因检测方法包括：PCR-SSP，PCR-SBT等。PCR-SSP即序列特 异性引物法，根据某一等位基因的核苷酸序列设计特异的引物，直接进行PCR，然后将扩增 产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物片段大小来判断；虽然该技术操作简便，对样本要 求不高，但由于此方法需要进行电泳，在操作过程中易造成二次污染、时间长，而且在PCR 过程中容易造成二聚体等非目的基因产物，从而易造成假阳性结果。PCR-SBT即直接测序 法，该方法可直接获得DNA序列，鉴定所有可能存在的多态性，为最直接的方法，同时特异 性强，灵敏度高，是国际公认的HLA等位基因分型方法的"金标准";但是由于该方法成本高、 耗时长，同时目的基因序列的特殊性、引物设计等多种因素，测序结果会出现套峰，不利于 结果的判读，使得PCR-SBT法存在着模棱两可的结果。尤其，操作繁琐，耗费时间，价格昂贵 等缺点已经逐渐不能满足现代医学检测"快速、简便"的特点。因此，对HLA等位基因的检 测，实时荧光定量PCR法被越来越多的人所推荐，该方法是在普通PCR反应体系中加入荧光 基团或荧光染料，利用信号积累检测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线或测量指数 扩增期的荧光值来进行定量或者定性的方法；该技术不仅能实现对DNA模板的定量，而且 灵敏度高、特异性强、稳定性好、能实现多重反应、反应后不需要开盖避免了二次污染。目前 已广泛应用于分子生物学研宄和医学研宄等领域。 虽然HLA-B*57:01的基因检测有重要的临床意义，但迄今为止HLA-B*57:01的基 因检测仍面临着很多问题。目前针对HLA-B*57:01的检测技术以PCR-SSP方法为主，该方 法需要在PCR之后进行琼脂糖凝胶电泳，作为HLA-B*57:01基因检测的金标准PCR-SBT测 序法，这些方法都需要在PCR之后开管，易造成基因扩增产物污染，且检测通量较低、操作 繁琐、成本高、时间长。 考虑到HLA等位基因的多态性，HLA-B*57:01等位基因特异性引物和探针的 前期准备和具体设计需要进行充分的研宄和实验，目前尚未见有关文献披露合适的 HLA-B*57:01等位基因特异性引物和探针。
技术实现思路
本专利技术的目的是在现有的PCR技术基础上，提供一种更加简便、快速、高通量、特 异性高的实时定量荧光PCR方法来检测人类白细胞抗原等位基因 HLA-B*57:01，以改善现 有技术上所存在的缺陷。本方法能为艾滋病患者服用阿巴卡韦后出现过敏反应的可能性的 判断提供有意义的参考，从而有利于HLA-B*57:01基因型指导下的阿巴卡韦的安全用药。 本专利技术在设计HLA-B*57:01等位基因特异性引物和探针之前，通过HLA-B中3500 个其它等位基因序列的比对，发现HLA-B*57:01与多个HLA-B等位基因都具有很高的同源 性，尤其是HLA-B*57:01与HAL-B*58:01等位基因序列最为相似；同时，HLA-B*57:01等位 基因的特异性位点相对来说较少，这些针对HLA-B*57:01等位基因特异性的位点主要分布 在外显子2和内含子2的区域中。然后根据特异性位点附近的区域，结合等位基因阻滞突 变系统（ARMS)的方法，设计TaqMan探针检测的特异性引物（可排除大多数HLA-B等位基 因）以及特异性探针（主要区别HLA-B*58等位基因），因此，探针和引物设计的位置能够 排除其它HLA-B等位基因的结合、识别，尤其是HLA_B*58:01等位基因。采用TaqMan探针 法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段，通过扩增曲线的分析结果，来判断未知样本是否携带 HLA-B*57:01等位基因。 具体而言，本专利技术主要设计了以下引物序列： (1)HLA-B*57:01特异引物和探针 上游引物 Fp :5' -AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3' 下游引物 Rp : 5 ' -TGAAACCGGGTAAACGCG-3 ' 探针 Probe : 5 ' -HEX-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC-BHQ2-3 ' (2) β -Globin内参引物和探针： 上游引物 Fp : 5 ' -AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3 ' 下游引物 Rp :5' -TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3' 配套探针 Probe : 5 ' -FAM-AGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGG-BHQ2-3 ' 其中，FAM为6-carboxyfluoresc本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于TaqMan探针实时荧光PCR法检测HLA‑B*57:01等位基因的引物探针组合，其特征在于，包括以下特异性引物和探针序列：上游引物Fp：5’‑AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‑3’下游引物Rp:5’‑TGAAACCGGGTAAACGCG‑3’探针Probe：5’‑HEX‑TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC‑BHQ2‑3’其中，HEX为6‑carboxy‑hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher‑2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩敏，康星，刘正斌，王会娟，陈融，周少荷，陈超，
申请(专利权)人：陕西佰美基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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