本发明专利技术公开了一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子PLW03和PLW04及其应用。具体地，本发明专利技术提供了能够用于产志贺毒素大肠杆菌PCR检测的多核苷酸以及与之相配合的引物对，采用合适的骨架质粒将所述多核苷酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明专利技术的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物工程
的质粒分子，具体涉及一种适用于产志贺毒素 大肠杆菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其构建方法、定量方法和应用。
技术介绍
产志贺毒素大肠杆菌是一种与公共卫生密切相关的致病性大肠杆菌，可引起出血 性结肠炎、溶血性尿毒综合症等疾病。自1982年Riley等在美国首次分离该菌以来，英国、 加拿大、日本和我国都相继有产志贺毒素大肠杆菌暴发的报道。产志贺毒素大肠杆菌作为 一种人畜共患病原菌，可以在畜禽中流行和传播，并通过动物源性食品进行扩散。目前，国 内诊断产志贺毒素大肠杆菌主要依靠细菌培养、生化反应（包括山梨醇一麦康凯琼脂筛选 等）和血清学鉴定。同时，采用志贺样毒素检测进行确证试验。上述方法检测周期长，操作 繁琐，往往达不到疫情控制的要求。而在分子水平方面，如PCR方法则可以快速、灵敏地检 测产志贺毒素大肠杆菌大肠杆菌。本文研制的产志贺毒素大肠杆菌大肠杆菌定量检测用质 粒分子是指一种含有产志贺毒素大肠杆菌的主要毒力因子stxl和stx2编码基因序列片段 的重组质粒分子标准物质。质粒标准分子在大肠杆菌核酸扩增（PCR)荧光检测试剂盒中是 很好的标准阳性物质替代物。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易 于扩增，所以可提供稳定含量的标准物质，并且纯度较高；另外具有操作容易，稳定性高的 优点。 在实际大肠杆菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分 子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA 分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于产志贺毒素大肠杆菌检测的质粒标准分子及其 应用。 本专利技术的第一方面，提供了一种检测产志贺毒素大肠杆菌的试剂盒，所述试剂盒 中包括： 标准分子，所述标准分子中含有SEQ ID NO. :1和/SEQ ID NO. :2所示的多核苷酸。 在另一优选例中，所述标准分子的序列如SEQ ID NO. :3或4所示。 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物序列，所述引物序列用于特异性扩增 SEQ ID NO. :1所示的序列，所述引物序列选自下组： (I)SEQ ID NO. :5 和 SEQ ID NO. :6 所示的引物序列； (2) SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 所示的引物序列；和 (3) SEQ ID NO. :9 和 SEQ ID NO. : 10 所示的引物序列。 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物序列，所述引物序列用于特异性扩增 SEQ ID NO. :2所示的序列，所述引物序列选自下组： (I)SEQ ID NO. : 13 和 SEQ ID NO. : 14 所示的引物序列； (2) SEQ ID NO. : 15 和 SEQ ID NO. : 16 所示的引物序列；和 (3) SEQ ID NO. : 17 和 SEQ ID NO. : 18 所示的引物序列。 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括探针序列，所述探针序列分别针对产志贺 毒素 stxl基因和/或产志贺毒素 stx2基因。 在另一优选例中，所述探针序列如SEQ ID NO. :21和/或SEQ ID NO. :22所示。 本专利技术的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含产志贺毒素 大肠杆囷毒力因子stxl和stx2的基因序列。 在另一优选例中，所述产志贺毒素大肠杆菌毒力因子stxl的基因序列选自下组： (a)序列如SEQ ID NO. : 1所示的多核苷酸序列； (b)核苷酸序列与SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列； (c)序列与SEQ ID NO. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为 50bp-400bp (较佳地为100-200bp，更佳地100-150bp)的多核苷酸序列。 (d)与（a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。 在另一优选例中，所述stx2的基因序列选自下组： (a)序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列； (b)核苷酸序列与SEQ ID NO: 2所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的多 核苷酸序列； (c)序列与SEQ ID N0:2所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为 50bp-400bp (较佳地为100-200bp，更佳地100-150bp)的多核苷酸序列。 (d)与（a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。 在另一优选例中，所述分离的多核苷酸其序列如SEQ ID NO. : 1或2所示。 本专利技术的第三方面，提供了一种分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本专利技术 第二方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。 在另一优选例中，所述DNA构建物中的线性酶切位点位于SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO. : 2所示序列的两端。 在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。 在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。 在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为产志贺毒素大肠杆菌检测的标准分 子（质粒标准分子）。 在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体，并且所述质粒或表达载体 的骨架质粒选自下组 ：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。 在另一优选例中，所述DNA构建物的序列如SEQ ID NO :3或SEQ ID NO. : 4所示。 本专利技术的第四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括本专利技术第二方面所述 多核苷酸或者本专利技术第三方面所述DNA构建物。 在另一优选例中，所述试剂盒为检测产志贺毒素 stxl基因的试剂盒，所述试剂盒 中还包括选自下组的引物序列： (I)SEQ ID NO. :5 和 SEQ ID NO. :6 所示的引物序列； (2) SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 所示的引物序列； (3) SEQ ID NO. :9 和 SEQ ID NO. : 10 所示的引物序列；和 (4) SEQ ID NO. : 11 和 SEQ ID NO. : 12 所示的引物序列。 在另一优选例中，所述试剂盒为检测产志贺毒素 stx2基因的试剂盒，所述试剂盒 中还包括选自下组的引物序列： (I)SEQ ID NO. : 13 和 SEQ ID NO. : 14 所示的引物序列； (2) SEQ ID NO. : I5 和 SEQ ID NO. : I6 所示的引物序列； (3) SEQ ID NO. : 17 和 SEQ ID NO. : 18 所示的引物序列；和 (4) SEQ ID NO. : I9 和 SEQ ID NO. :2〇 所示的引物序列。 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括分别针对产志贺毒素 stxl基因的探针SEQ ID NO. : 21和/或产志贺毒素 stx2基因的探针SEQ ID NO. : 22。 本专利技术的第五方面，提供了如本专利技术第二方面本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测产志贺毒素大肠杆菌的试剂盒，其特在于，所述试剂盒中包括：标准分子，所述标准分子中含有SEQ ID NO.:1和/或SEQ ID NO.:2所示的多核苷酸；优选地，所述试剂盒中还包括引物序列，所述引物序列用于特异性扩增SEQ ID NO.:1所示的序列，所述引物序列选自下组：(1)SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示的引物序列；(2)SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示的引物序列；和(3)SEQ ID NO.:9和SEQ ID NO.:10所示的引物序列；和/或，所述试剂盒中还包括用于特异性扩增SEQ ID NO.:2所示序列的引物序列，所述引物序列选自下组：(1)SEQ ID NO.:13和SEQ ID NO.:14所示的引物序列；(2)SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:16所示的引物序列；和(3)SEQ ID NO.:17和SEQ ID NO.:18所示的引物序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，梁文，许丽，李妍，闻艳丽，李兰英，任淑贞，
申请(专利权)人：上海市计量测试技术研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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