类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333的凝乳酶及制备方法。所述的方法包括以下的步骤：(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的发酵液离心得发酵上清液；(2)将发酵上清液与硫酸铵混合，至发酵液中硫酸铵的饱和度为50～75％，得混合液，2～6℃静置混合液0～5小时，离心收集沉淀物；(3)将沉淀物溶解，离心，取上清液即得。所述的方法大幅简化了凝乳酶的制备工艺步骤；并且与使用乙醇提取凝乳酶相比，大大节约了生产成本，操作简便有效，安全可靠，有利于应用于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种类芽孢杆菌CGMCC No. 8333凝乳酶及制 备方法。
技术介绍
与植物来源和动物来源的凝乳酶相比较，微生物来源的凝乳酶具有生产成本低、 生化多样性高、基因易改造的优势。目前，越来越多的报道说明微生物的胞外蛋白酶具有凝 乳功能，部分微生物的凝乳酶已实现大规模工业化生产，并广泛应用于干酪生产中。能够产 生具有一定凝乳作用的胞外蛋白酶的微生物主要属于放线菌、细菌和霉菌等的范畴，包括 放线菌中的链霉菌属、小单孢菌属、马杜拉放线菌属，霉菌中根霉、总状毛霉、微小毛霉、米 黑毛霉、易脆毛霉，细菌中粟疫菌、寄生内座壳菌以及其他通过基因工程或辐照获得的高产 凝乳酶的菌株等。 将凝乳酶从发酵上清中分离出来并实现凝乳酶的高效回收是分离纯化、酶学性质 研宄以及工业化生产凝乳酶的前提和基础。常用的分离方法有盐析法、有机溶剂沉淀法 (乙醇、丙酮）以及等电点法，其中，盐析、乙醇和丙酮沉淀应用最为广泛。例如，有学者使 用1%氯化钠溶液浸提微小毛霉发酵液中的凝乳酶，后用95%的乙醇对浸提物进行沉淀； 有学者使用乙醇按不同比例分步提取微小毛霉发酵液中的凝乳酶；还有学者以总状毛霉 R132的发酵液为研宄对象，对其超滤后进行乙醇分步提取。另有其他学者利用丙酮、乙醇等 对栗疫菌、根霉、青霉、曲霉、枯草芽孢杆菌、粘球菌、粪肠球菌产凝乳酶进行初步分离提取。 中国专利申请（CN103740618A)公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种类芽孢杆 菌 BD3526，Paenibacillus damxungensis sp. ηον·，并将其于 2013 年 10 月 14 日保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No. 8333。该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。中国专利申 请（CN104450655A)公开了使用乙醇提取类芽孢杆菌BD3526麸皮发酵液上清中凝乳酶，但 是其操作工艺复杂，所得凝乳酶的回收率低，难以满足大规模工业化生产的需要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对目前利用类芽孢杆菌麸皮发酵物制备凝乳酶 时，所得的发酵物粘稠难以将凝乳酶纯化分离，所得的凝乳酶回收率低，难以满足大规模工 业化生产的需要的不足，提供一种利用类芽孢杆菌麸皮发酵物制备凝乳酶的方法。所述的 方法达到了凝乳酶回收率高和粗酶样品中多糖含量较低的良好效果。 本专利技术专利技术人发现，类芽孢杆菌CGMCC No. 8333具有高产凝乳酶的特性外，还具有 很强的胞外多糖的合成能力，发酵液中的多糖具有强的悬浮性能，不能实现凝乳酶和胞外 多糖的有效分离。利用乙醇沉淀时，凝乳酶回收率虽高，但混杂了很多的胞外多糖，溶解性 能差、黏度很高，限制了后期分离纯化和酶学性质研宄，在工业化生产上也不具备可行性， 因此本专利技术人对类芽孢杆菌CGMCC No. 8333发酵液分离纯化凝乳酶的工艺进行调整改进。 本专利技术提供一种利用类芽抱杆菌（Paenibacillus damxungensis sp. nov. )CGMCC No. 8333发酵液制备凝乳酶的方法，其包括以下的步骤： (1)将保藏编号为CGMCC No. 8333的类芽孢杆菌的发酵液离心得发酵上清液； (2)将步骤（1)所得发酵上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的 饱和度为50~75%，2~6°C静置混合液0~5h，离心收集沉淀物； ⑶将步骤⑵所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。 步骤（1)为：将保藏编号为CGMCC No. 8333的类芽孢杆菌的发酵液离心得发酵上 清液。其中，较佳地，发酵液是由包括以下的步骤制备而得的：将保藏编号为CGMCC No. 8333 的类芽孢杆菌的种子液接种于麸皮培养基发酵培养得发酵液。所述的麸皮培养基为本领域 常规的麸皮培养基，其包括麸皮和水。所述的麸皮为本领域常规的麸皮，较佳地为小麦麸 皮。所述麸皮的含量为本领域常规的含量，较佳地为1 %~5 %，更佳地为2 %，所述百分比 为质量百分比。较佳地，所述发酵培养在锥形瓶中进行，更佳地在250mL锥形瓶中进行。所 述锥形瓶中所述的麸皮培养基的装液量为本领域常规装液量，更佳地为50mL。所述发酵培 养的时间为本领域常规的时间，较佳地为48~72小时。所述发酵培养的温度为本领域常 规的温度，较佳地为28~30°C。所述的种子液的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为 2~4%，所述百分比为体积百分比。所述发酵培养的方式为本领域常规的方式，较佳地为 震荡培养。所述震荡培养的速度为本领域常规的速度，较佳地为180~300r/min。 较佳地，所述的种子液是由包括以下的步骤制备而得的：将保藏编号为CGMCC No. 8333的类芽孢杆菌接种于种子培养基种子培养得种子液。所述的种子培养基为本领域 常规的种子培养基，较佳地为TYC培养基。所述的TYC培养基为常规的TYC培养基，较佳的 由以下组分组成：酪蛋白胨或胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5. 0g/L，L-胱氨酸0. 2g/ L，乙酸钠 20g/L，Na2SO4 0· lg/L，NaCl lg/L，Na2HPO4 · 12H20 2g/L，NaHCO3 2g/L，琼脂 15 ~ 20g/L，余量为水。所述种子培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为20小时。所述种子 培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为28~30°C。所述离心的时间为本领域常规的时 间，较佳地为15min。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为4°C。所述离心的速 度为本领域常规的速度，较佳地为15000g。 步骤（2)为：将步骤（1)所得发酵上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫 酸铵的饱和度为50~75 %，2~6 °C静置混合液0~5小时，离心收集沉淀物。其中，较佳 地，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50~60%，更佳地为60%。所述静置的时间为0~5 小时，较佳地为2小时。所述静置的温度为2~6°C，较佳地为2~4°C。所述离心的时间 为本领域常规的时间，较佳地为15分钟。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为 4°C。所述离心完成后，初步获得了凝乳酶含量较高的粗提物。 _4] 步骤⑶为：将步骤⑵所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。其中，所 述溶解的溶剂为本领域常规的溶剂，较佳地为水或PBS溶液。所述的PBS溶液为本领域常 规的PBS溶液，较佳地为0. 02mol/L、pH 7. 0的PBS溶液。所述离心的时间为本领域常规的 时间，较佳地为15分钟。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为4°C。所述离心的 速度为本领域常规的速度，较佳地为15000g。所述离心的步骤回收率残留在凝乳酶中不溶 解的杂质，如菌体、培养基和其他的代谢产物等。较佳地，步骤（3)还包括将步骤（3)所述 上清液冻干的步骤。所述的冻干为本领域常规的冻干，能够将上清液冷冻干燥即可。 本专利技术提供一种由上述的方法制备获得的凝乳酶。 所述的凝乳酶具有较高的酶活性，凝乳酶活回收率高达21. 86%，适用于工业化应 用生产。 本专利技术所述的类芽孢杆菌CGMCC No. 8333从西藏本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333的发酵液制备凝乳酶的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的发酵液离心得发酵上清液；(2)将步骤(1)所得发酵上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50～75％，2～6℃静置混合液0～5小时，离心收集沉淀物；(3)将步骤(2)所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杭锋，王钦博，刘振民，陈卫，穆海波，王国骄，刘沛毅，洪青，雍靖怡，齐晓彦，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31