本发明专利技术公开了cupin蛋白结构域在制备α‑淀粉酶抑制剂中的应用。本发明专利技术中发现了植物贮藏蛋白cupin结构具有α‑淀粉酶抑制剂功能，它是通过鹰嘴豆种子中α‑淀粉酶抑制剂的纯化及鉴定、蛋白原核表达并测定其抑制活性、cupin结构域缺失及氨基酸突变、来源于其他作物具有cupin结构域蛋白的原核表达并测定α‑淀粉酶抑制剂活性、测定cupin结构域蛋白生物学特性等手段实现的，并发现cupin结构域影响蛋白的α‑淀粉酶抑制活性具有普遍性。本发明专利技术可操作性强、重复性好、效率高、适用性强，对进一步发掘植物中贮藏蛋白类型α‑淀粉酶抑制剂具有广泛而深远的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及cupin蛋白结构域在制备α -淀粉酶抑制剂中 的应用。
技术介绍
高等植物在种子成熟过程中能够合成大量的贮藏蛋白并作为种子萌发过程中最 初的物质和能量来源，其含量一般能够占到种子中总蛋白的80%左右。种子中贮藏蛋白根 据溶解性不同将其分为溶于水的白蛋白、溶于稀盐溶液的球蛋白、溶于乙醇/水混合物的 醇溶蛋白和溶于稀酸或稀碱的谷蛋白。某些贮藏蛋白能够有效地抑制真菌和细菌的生长， 帮助植物抵抗外界病原体的侵染，对植物体的防御体系起到重要作用；贮藏蛋白除了能够 为人类提供充足的营养物质外，其中一些蛋白还具有临床应用研宄价值，已有研宄表明植 物种子中一些贮藏蛋白属于食物致敏原蛋白，能够引起人体免疫反应，如大豆、鹰嘴豆、黄 芥、蓖麻等植物种子中的一些贮藏蛋白能够与过敏病人体内的血清IgE抗体结合，引发过 敏反应，所以对种子中贮藏蛋白功能的研宄具有重要的研宄和利用价值。 蛋白类α-淀粉酶抑制剂广泛分布存在于动物、植物和微生物体内。植物在生 物进化过程中由于不断受到来自于昆虫和病原微生物的侵害而进化产生淀粉酶抑制剂 等生物防御物质来提高自身的生存几率，获得生存进化上的优势。在植物籽实中α-淀 粉酶抑制剂含量尤为丰富多样，尤其在禾本科和豆科植物的种子果实中存在着多种类型 的蛋白类α-淀粉酶抑制剂，对植物本身起到重要的保护作用。植物来源蛋白类α-淀 粉酶抑制剂目前可分为六类：Kunitz_like、Knottin-like、Cereal-like、Lectin-like、 γ -Purothionin-Iike和Thaumatin-like。α -淀粉酶能够将淀粉水解为单糖葡萄糖作为 机体吸收的能量来源，在人们日常生活膳食中发挥着重要的作用。α -淀粉酶抑制剂能够有 效地不同来源的α-淀粉酶结合形成酶-抑制剂的复合物，使α-淀粉酶活性丧失或降低 来阻碍食物中碳水化合物的水解和消化。基于α-淀粉酶抑制剂自身的特点，α-淀粉酶 抑制剂在医学和农业生产中有广泛的应用前景，一方面α-淀粉酶抑制剂可以作为防治和 治疗高血糖、糖尿病及高血脂等疾病的药物，另一方面也可以应用于日常生活中保健，控制 饮食，减少肥胖；同时α-淀粉酶抑制剂基因及产物对农业昆虫防治和减少杀虫剂使用、保 护生态环境有重要的应用价值。 与其他蛋白家族相比，cupin结构域蛋白家族是迄今为止发现的生物化学功能范 围最广的蛋白家族，cupin家族蛋白功能涉及到细菌细胞壁结构中碳水化合物修饰所需的 异构酶与表异构酶、植物种子中贮藏蛋白以及哺乳动物中转录因子等。目前初步将cupin 家族蛋白至少分为18个种类，但随着对此家族蛋白的深入研宄，关于cupin蛋白更多的生 物功能将被陆续揭示，但在cupin结构域蛋白中尚未有具有α -淀粉酶抑制剂活性的蛋白 种类得以相关研宄与报道。
技术实现思路
本专利技术的目的提供具有cupin结构域的蛋白在制备α -淀粉酶抑制剂中的应用。 本专利技术的目的可通过如下技术方案实现： cupin蛋白结构域在制备α -淀粉酶抑制剂中的应用。 所述的α-淀粉酶优选来源于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌的α-淀粉酶； 进一步优选来源于人唾液的α-淀粉酶，来源于棉铃虫幼虫唾液、中肠和血液中的α-淀粉 酶，来源于马铃薯甲虫幼虫唾液和中肠中的α-淀粉酶，来源于猪胰腺、玉米、枯草芽孢杆 菌或米曲霉的α -淀粉酶。 所述的cupin蛋白结构域为天然存在或人为进行改造的与cupin结构具有相同或 相似性的蛋白结构域。 cupin结构是指由至少6个β -折叠片形成的桶状结构，cupin结构域由两个保守 的基本区域组成，每个区域中个含有两个β折叠二级结构，两个基本保守区域之间通过一 段可变化的环状结构相连接；一个保守区域的基本构成为G(X) 5HXH(X)mE(X)6G，另一个保 守区域基本构成为G (X) 5PXG (X) 2H(X) 3Ν，但保守区域中的氨基酸在一些cupin家族蛋白中 表现出非保守性。 所述的cupin蛋白结构域来源于高等绿色植物、芽孢杆菌、子囊菌中，含有cupin 结构域蛋白家族包括种子IlS和7S贮藏蛋白、萌发素以及多种功能性蛋白。 所述的具有cupin结构域的蛋白优选来自鹰嘴豆IC藏蛋白Q9SMJ4蛋白。所述的 鹰嘴豆贮藏蛋白Q9SMJ4蛋白含有2个cupin结构域，分别位于其α和β亚基链上，其结 构域范围分别为36-189aa和333-444aa。 原核表达鹰嘴豆种子中具有cupin结构的α -淀粉酶抑制剂蛋白CL-AI-α对来 源于人唾液、猪胰腺、玉米、枯草芽孢杆菌和米曲霉的α-淀粉酶表现出抑制作用，抑制率 分别为 71. 58%、74· 32%、67· 74%、53· 45%和 71. 11%。 原核表达鹰嘴豆种子中具有cupin结构的α -淀粉酶抑制剂蛋白CL-ΑΙ-α对 来源于棉铃虫幼虫唾液、中肠和血液中的a -淀粉酶有抑制作用，抑制率分别为39. 09%、 68. 42%和96. 21%，表明对棉铃虫的防治有一定的利用价值。 cupin蛋白结构域在制备防治昆虫的制剂中的应用。 cupin蛋白结构域优选来自鹰嘴豆IC藏蛋白Q9SMJ4蛋白的2个cupin结构域。 所述的昆虫优选马铃薯甲虫，但还包括其他种类的昆虫。 原核表达鹰嘴豆种子中具有cupin结构的a -淀粉酶抑制剂蛋白CL-AI-a对 来源于马铃薯甲虫幼虫唾液和中肠中的a -淀粉酶有抑制作用，抑制率分别为28. 71%、 55. 26 %，表明对马铃薯甲虫的防治有一定的利用价值。 用浸有原核表达鹰嘴豆种子中具有cupin结构的a -淀粉酶抑制剂蛋白CL-AI的 叶片饲喂马铃薯甲虫幼虫能够减缓幼虫体重的增加从而抑制其生长发育，饲喂CL-AI-a、 CL-AI及CL-AI包涵体复性蛋白CL-AI (R)的马铃薯幼虫体重没有增加反而略有减轻，体重 分别减轻了 4. 38%、0. 83%和7. 77%，而饲喂CL-ΑΙ-β蛋白的幼虫体重略有增加，其增加 率仅为0. 91% ;而对照组马铃薯幼虫体重增加明显，增加了 50. 62%，说明对马铃薯甲虫田 间防治有一定的实用价值。 cupin蛋白结构域在制备种子萌发抑制剂中的应用。 所述的cupin蛋白结构域优选来自鹰嘴豆IC藏蛋白Q9SMJ4蛋白的2个cupin结 构域。 所属的种子包含但不限于水稻、玉米、小麦。 用原核表达鹰嘴豆种子中具有cupin结构的α -淀粉酶抑制剂蛋白CL-AI- α处 理发芽中的水稻、小麦及玉米种子，结果表明CL-ΑΙ-α蛋白对种子的发芽率影响不明显， 但明显地抑制种子萌动后的生长速度，种子根长和芽长相对于对照，都表现出明显生长缓 慢的现象，而植株在干重和鲜重方面没有太大差异，表明其在抑制种子发芽方面具有利用 价值。 有益效果 本专利技术针对一种IC藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂抑制活性相关结构域（cupin)， 从理论与实践中阐明IC藏蛋白类型α -淀粉酶抑制剂cupin结构域与抑制活性之间的相关 性及此cupin结构域引起蛋白具有α -淀粉酶抑制活性现象的普遍和广泛性的科学问题， 首次从多个方面证明了 cupin结构域与蛋白α -淀粉酶抑制活性之间的关系。本文档来自技高网...
【技术保护点】
cupin蛋白结构域在制备α‑淀粉酶抑制剂中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：麻浩，王占奎，王爽，克玉木·米吉提，王泽，顾爱星，张桦，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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