家族特异性遗传病关联等位基因单体型变异标签确认方法技术

本发明专利技术提供了一种家族特异性遗传病关联等位基因单体型变异标签确认方法。从孟德尔遗传疾病的家系中至少选取5人提取基因组DNA；获取与疾病相关的目标基因信息；对每个基因组DNA中的目标基因区间的DNA片段进行扩增、测序；分别挑选每个基因组DNA在目标基因区间存在的所有变异位点；获取每个变异位点在每个基因组DNA的基因型；变异位点在每个基因组DNA的分型结果结合疾病性状进行遗传分析，从而确认该疾病关联的等位基因单体型变异标签。本发明专利技术采用只针对特定疾病关联基因外显子的PCR扩增子测序的方式，目标区域小，测序成本低，实施周期短，结果可靠。可应用于试管婴儿胚胎植入前遗传诊断PGD或孕期胎儿诊断PD。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于遗传学、分子生物学，具体涉及一种家族特异性遗传病关联等位基因 单体型变异标签确认方法。
技术介绍
胚胎植入前遗传诊断PGD是一种用于判断待植入试管婴儿胚胎是否具有疾病风 险或者是携带疾病等位基因的方法统称。孕期胎儿诊断ro则是一种判断怀孕后的胎儿是 否具有疾病风险或者是携带疾病等位基因的方法统称。随着细胞DNA序列特异性荧光标记 以及单细胞测序方法的出现，PGD成为在胚胎早期检测单基因上所发生变异而导致遗传疾 病的一种非常有效的处理手段。但是该方法所要求的单细胞或极少量DNA操作要求较高。 而则可以采集多细胞的胎儿样本，DNA操作就相对容易。PGD和ro有的是针对整条染色 体的(整倍体异常、例如唐氏综合症患儿)，有的则是针对局部DNA片段范围，甚至单个核苷 酸的变异(含碱基的替换、插入以及缺失)来进行的。通过这种诊断，可以通过胚胎植入干预 或者中止妊娠的方式在家族后代有效地减小疾病的风险，达到优生目的。 为了达到诊断局部DNA片段变异的目的，首先需要在某一家族里确认针对其遗传 性疾病的特定DNA区域的变异标签，即在某一基因区域的找到局部替换、插入或缺失。这是 进一步进行PGD和ro的重要前提。在此，为了确认针对遗传性疾病在特定家族里的特定 参考物信息标签，即以较为经济且可靠的方式在特定DNA区域的找到局部替换、插入或缺 失，并确认其与该家族的遗传疾病的关联性，是操作PGD和ro的重要前提。到目前为止，虽 然有报道某些疾病关联点突变的某些个例，并可用于相应的P⑶和ro诊断，但是针对不同 疾病甚至同一症状疾病在不同家族里个性化PGD标签，一直都没有出现过统一的标准化方 法。不同的机构或研究人员根据各自偏好，采用不同的采样标准和技术路线，获取各自认为 可靠的PGD或ro诊断标签。因此，专利技术了一种方法，寻找针对不同单基因变异疾病关联的 一个或多个家族特异性变异位点，并以其为目标设计用于PGD或者ro胚胎诊断的参考物。
技术实现思路
针对现有技术不足，本专利技术的目的是提供一种家族特异性遗传病关联等位基因单 体型变异标签确认方法。 为实现上述目的，本专利技术提供了一种家族特异性遗传病关联等位基因单体型变异 标签确认方法。 -种，包括以下步骤， 1)从单个位点基因变异导致的遗传性疾病即孟德尔遗传疾病的家系中至少选取5 人提取基因组DNA样本； 2)获取与所述疾病相关的目标基因信息； 3)对步骤1)提取的每个基因组DNA样本中的所述目标基因区间的DNA片段进行 扩增、测序； 4)分别挑选每个基因组DNA样本在所述目标基因区间存在的所有变异位点； 5)获取每个所述变异位点在每个基因组DNA样本的纯合或杂合状态基因型AA、Aa 或aa ; 6)所述变异位点在每个基因组DNA样本的分型结果结合疾病性状进行遗传分析 以确认疾病关联等位基因单体型，从而确认该疾病关联的等位基因单体型变异标签。 优选的，所述步骤1 )，所选孟德尔遗传疾病的家系成员中，包括成员A为作为孟德 尔遗传疾病患者或者缺陷基因单体型携带者并即将进行生育者，成员B为成员A的父亲，成 员C为成员A的母亲，成员D为阳性对照，即患孟德尔遗传疾病，成员E为阴性对照，即无所 述孟德尔遗传疾病性状。 进一步地,如果成员A的患疾病风险来自父系，则成员D和成员E从父系家族成员 中选择；如果成员A的疾病风险来自母系，则成员D和成员E从母系家族成员中选择，其中 成员E与家族中的其他疾病患者有直接的血缘关系，即父母、子女或者兄弟姐妹。 优选的，全基因组DNA样本来源于体细胞，并不局限于外周血，任何具有等位基因 二倍体信息的体细胞，例如口腔上皮细胞、组织培养物、甚至毛发等临床样本。 优选的，步骤2)的目标基因信息通过文献和/或数据库确定外显子框架。 进一步地，步骤3)中所述扩增的引物设计在内含子上并覆盖外显子，或者设计多 个扩增子引物而全面覆盖较长外显子。 优选的，步骤3)中所述测序为Sanger法测序或高通量测序。 进一步地，所述测序包括Sanger单克隆测序以及Illumina HiSeq、Life Technologies Ion Torrent、ABI SOLiD 或 454pyrosequencing 等为代表的高通量测序技 术（High-throughput sequencing)方法。在高通量测序中，又被称之为多重扩增子测序 (Multiplex Amplicon Sequencing)。 进一步地，步骤4)中所述变异位点由缺失变异、替换变异或插入变异导致。 优选的，步骤6)所述的遗传分析采用如下基因分型和疾病状态对照表，如果找到 记录，则二元多态性中罕见的等位基因单体型a作为单体型变异标签，其中，该对照表中Aa 表示二倍体等位基因状态处于杂合子状态，AA或aa表示二倍体等位基因处于纯合子状态， " + "表示疾病性状为阳性，""表示疾病性状为阴性，【主权项】1. 一种，其特征在于，包括 以下步骤， 1) 从单个位点基因变异导致的遗传性疾病即孟德尔遗传疾病的家系中至少选取5人 提取基因组DNA样本； 2) 获取与所述疾病相关的目标基因信息； 3) 对步骤1)提取的每个基因组DNA样本中的所述目标基因区间的DNA片段进行扩增、 测序； 4) 分别挑选每个基因组DNA样本在所述目标基因区间存在的所有变异位点； 5) 获取每个所述变异位点在每个基因组DNA样本的纯合或杂合状态基因型AA、Aa或 BB ; 6) 所述变异位点在每个基因组DNA样本的分型结果结合疾病性状进行遗传分析以确 认疾病关联等位基因单体型，从而确认该疾病关联的等位基因单体型变异标签。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1 )，所选孟德尔遗传疾病的家系 成员中，包括成员A为作为孟德尔遗传疾病患者或者缺陷基因单体型携带者并即将进行生 育者，成员B为成员A的父亲，成员C为成员A的母亲，成员D为阳性对照，即患孟德尔遗传 疾病，成员E为阴性对照，即无所述孟德尔遗传疾病性状。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，如果成员A的患疾病风险来自父系，则成 员D和成员E从父系家族成员中选择；如果成员A的疾病风险来自母系，则成员D和成员E 从母系家族成员中选择，其中成员E与家族中的其他疾病患者有直接的血缘关系，即父母、 子女或者兄弟姐妹。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)的目标基因信息通过文献和/或 数据库确定外显子框架。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述扩增的引物设计在内含子 上并覆盖外显子，或者设计多个扩增子引物而全面覆盖较长外显子。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述测序为Sanger法测序或高 通量测序。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述变异位点由缺失变异、替换 变异或插入变异导致。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述的遗传分析采用如下基因分 型和疾病状态对照表，如果找到记录，则二元多态性中罕见的等位基因单体型a作为单体 型变异标签，其中，该对照表中Aa表示二倍体等位基因状态处于杂合子状态，AA或aa表示 二倍体等位基因处于纯合子状态，" + "本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种家族特异性遗传病关联等位基因单体型变异标签确认方法，其特征在于，包括以下步骤，1）从单个位点基因变异导致的遗传性疾病即孟德尔遗传疾病的家系中至少选取5人提取基因组DNA样本；2）获取与所述疾病相关的目标基因信息；3）对步骤1）提取的每个基因组DNA样本中的所述目标基因区间的DNA片段进行扩增、测序；4）分别挑选每个基因组DNA样本在所述目标基因区间存在的所有变异位点；5）获取每个所述变异位点在每个基因组DNA样本的纯合或杂合状态基因型AA、Aa或aa；6）所述变异位点在每个基因组DNA样本的分型结果结合疾病性状进行遗传分析以确认疾病关联等位基因单体型，从而确认该疾病关联的等位基因单体型变异标签。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林巍，蔡长明，
申请(专利权)人：林巍，
类型：发明
国别省市：北京;11