一种鸡传染性支气管炎二价疫苗效力检验方法技术

本发明专利技术提供了一种鸡传染性支气管炎二价疫苗效力检验方法，同时提供了尤其适用于该方法的两株单克隆抗体细胞株。本发明专利技术在检测前先对二价疫苗中的抗原进行中和，得到仅含有一种抗原的待测样品再进行检测，从而避免了多抗原存在对检验结果所产生的交叉影响。与此同时，选择更加客观的定量分析方法并优化了相关工艺条件。本发明专利技术所提供的两株杂交瘤细胞性能优异，均具有与自身特异反应强、与另一抗原无交叉反应的特性，可以较好的将两株病毒区分开，尤其适用于本发明专利技术所述检测方法。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡传染性支气管炎二价疫苗效力检验方法
本专利技术涉及疫苗
，具体涉及一种鸡传染性支气管炎二价疫苗效力检验方法。
技术介绍
鸡传染性支气管炎(AvianInfectiousBronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus,IBV)引起的急性、高度接触性传染病。其多表现为鸡精神倦怠、被毛松乱及呼吸道症状，如气喘、呼吸困难，剖检后气管有大量分泌物。鸡支气管炎病毒按临床症状主要分为呼吸型、肾型、生殖道型及变异型。严重的鸡传染性支气管炎病可致鸡死亡，其病死率为40％-90％，即使不发生死亡也会对鸡的生产性能产生较大影响，因此对我国养禽业有极为重要的影响。对于本病的防治仍然是预防为主。随着对该病认识的深入和重视，针对不同临床型的疫苗也陆续被研究出来，市场上对不同临床型的多价多联疫苗的需求量也日益增加。对鸡传染性支气管炎多价疫苗效力检验一是用攻毒保护的实验方法，二是用高免血清中和的方法。攻毒保护的方法使用实验动物数量较多且用强毒操作存在散毒等生物安全风险。而用高免血清中和后接种鸡胚的方法，虽不直接接触强毒但由于血清中成分较为混杂，常出现交叉保护的问题，因此这种方法检测多价疫苗结果不准确。此外，传统的鸡胚检测法检测周期长达144小时，且判定阳性时使用观察鸡胚病变和称重的办法。该方法主观性较大，在称重过程中由于鸡胚在液体环境中本身附着液体量不一致，导致在判定临界值时误差较大。单克隆抗体制备技术今年来越来越多的应用与疾病检测、治疗的相关领域，其最大的优点在于制备出的抗体可针对某一抗原表位从而产生不同于其他病毒株的特异性抗体。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鸡传染性支气管炎二价疫苗效力检验方法，以克服现有技术中多价疫苗效力检验方法所存在的耗时长、不准确等技术问题。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种鸡传染性支气管炎K136株、H120株二价疫苗效力检验方法，包括以下步骤：1)利用第一杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或利用第二杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体；2)取待检验活疫苗与所述抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体混合，完全中和得到唯一抗原溶液；3)利用步骤2)所述唯一抗原溶液接种鸡胚，弃去接种后24h内死亡胚，至48h取出全部鸡胚；4)分别测定上述全部鸡胚尿囊液中病毒含量。优选的，步骤2)具体为：先将待检验活疫苗稀释至2羽剂量/mL再混合；在此基础上还可以进一步优选的，步骤2)具体为：混合比例为1:(0.5～2)(v/v)，混合后于22～28℃中和反应25～35min。优选的，步骤3)所述的接种方法为：将步骤2)得到的唯一抗原溶液依照其中抗原浓度分别稀释至10-2羽剂量/0.1ml、10-3羽剂量/0.1ml、10-4羽剂量/0.1ml，分别吸出0.1ml接种10日龄SPF鸡胚。优选的，步骤4)对病毒含量的测定是利用RT-PCR法实现的。优选的，步骤4)完毕后还包括步骤5)，所述步骤5)具体为：将步骤4)测定的结果确定出病毒感染阳性例，进而计算半数感染量。上述结果可以依据《中国兽药典》附录七规定的阳性例来确定。同时本专利技术还提供了一种权利要求1所述的第一杂交瘤细胞，其保藏编号为CCTCCC2014171。同时本专利技术还提供了一种权利要求1所述的第二杂交瘤细胞，其保藏编号为CCTCCC2014170。在以上技术方案中，保藏编号为CCTCCC2014171和CCTCCC2014170两种生物材料的保藏单位均为“中国典型培养物保藏中心”，其地址为“湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内”，二者保藏日期均为2014年9月4日。在以上技术方案中：所述第一杂交瘤细胞是具备分泌抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体的杂交瘤细胞；所述第二杂交瘤细胞是具备分泌抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体的杂交瘤细胞。本专利技术在检测前先对二价疫苗中的抗原进行中和，得到仅含有一种抗原的待测样品再进行检测，从而避免了多抗原存在对检验结果所产生的交叉影响，进而保证检测结果的客观性。与此同时，本专利技术选择对感染后鸡胚尿囊液中的病毒含量进行定量分析而非粗放的称重对比，能够更加准确的反应实验结果，同时使得检测时间显著降低。此外，本专利技术在公知方法的基础上对抗原抗体反应的混合条件、接种工艺做了相应的优选，使得优选工艺更加适合该检测方法。本专利技术所提供的两株杂交瘤细胞由专利技术人制备得到，其性能优异，均具有与自身特异反应强、与另一抗原无交叉反应的特性，可以较好的将两株病毒区分开，尤其适用于本专利技术所述检测方法。本专利技术利用相对简单的技术手段实现了良好的技术效果，从根本上解决了现有技术中用动物检验不安全和用血清检验不准确的问题，同时显著降低了检测时间和实施成本，具有突出的推广前景。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的术语“第一”、“第二”等并不表示任何顺序、数量或重要性，而仅用于区别一种物质和另一种物质。实施例1(两株杂交瘤细胞的制备)一、抗原的制备1、单克隆抗体6G8株抗原的制备将鸡传染性支气管炎病毒K136株接种于10日龄SPF鸡胚，6天后无菌收获鸡胚尿囊液。将尿囊液差速离心具体方法如下：取-20℃冻存的病毒液融化后，5000g，4℃离心30min，弃沉淀取上清液，再14000g，4℃离心20min，弃杂蛋白，取上清液。然后进行超速离心：将上一步得到的上清液以66100g(TYPE60Ti，BeckmanL8-M)4℃离心1.5h，弃上清，沉淀加入2mLTEN缓冲液(50mMTris-HCL、50mMNaCl、5mMNa2EDTA、PH7.4)，并在无菌条件下降沉淀吹打使其分散、溶解。放入-70℃冰箱备用。取少量浓缩后的病毒蛋白进行不同程度稀释，用紫外分光光度计测定病毒的OD260和OD280值，使OD值在0.3-0.7间，再用公式“蛋白浓度＝1.45OD280-0.74OD260”计算出稀释后的浓度，最后乘以稀释倍数，获得纯化病毒含量。2、单克隆抗体5D5株抗原的制备将鸡传染性支气管炎病毒H120株接种于10日龄SPF鸡胚，6天后无菌收获鸡胚尿囊液。其他步骤同上。二、杂交瘤细胞制备取适量的相应的病毒液与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射6周龄BALB/c小鼠，每只0.2ml；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡传染性支气管炎K136株、H120株二价疫苗效力检验方法，其特征在于包括以下步骤：1)利用第一杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或利用第二杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体；2)取待检验活疫苗与所述抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体混合，完全中和得到唯一抗原溶液；3)利用步骤2)所述唯一抗原溶液接种鸡胚，弃去接种后24h内死亡胚，至48h取出全部鸡胚；4)分别测定上述全部鸡胚尿囊液中病毒含量。

【技术特征摘要】
1.一种鸡传染性支气管炎K136株、H120株二价疫苗效力检验方法，其特征在于包括以下步骤：1)利用第一杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或利用第二杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体；2)取待检验活疫苗与所述抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体混合，完全中和得到唯一抗原溶液；3)利用步骤2)所述唯一抗原溶液接种鸡胚，弃去接种后24h内死亡胚，至48h取出全部鸡胚；4)分别测定上述全部鸡胚尿囊液中病毒含量；其中，所述第一杂交瘤细胞是保藏编号为CCTCCC2014171的杂交瘤细胞；所述第二杂交瘤细胞是保藏编号为CCTCCC2014170的杂交瘤细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈冰，李亚杰，杨保收，郁宏伟，梁武，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12