基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法，属于电化学传感技术领域。含有甲基化位点的发夹DNA在Dam甲基转移酶的作用下发生甲基化并被DpnI核酸内切酶剪切，释放出的单链DNA与电极表面的二茂铁-DNA的凸起部分杂交形成双链DNA进而被核酸外切酶III剪切为DNA碎片，使得二茂铁脱离电极表面而电流降低，电极表面的单链DNA与血红素形成G-四链体-血红素复合物的电流增强，通过二者电流强度的比例可实现Dam甲基转移酶的灵敏检测。

【技术实现步骤摘要】
基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法
本专利技术涉及一种基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法，属于电化学传感

技术介绍
DNA甲基化在人类基因表达中起着重要作用。在原核生物中，DNA的甲基化与DNA修复、基因表达调节、细胞周期调控等有着重要联系。在真核生物中，DNA的甲基化影响细胞分化、基因表达、染色体结构形成等一系列生物生理过程。DNA的甲基化过程是在DNA甲基转移酶的作用下，催化甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基从SAM转移到腺苷或者嘧啶上来实现的。异常DNA甲基化会导致正常的基因表达和细胞功能发生混乱。研究表明，CPG岛的启动子突变的甲基化与多种肿瘤和癌症密切相关。DNA甲基转移酶活性的突变和白血病的发病机理相关也已得到证实。因此，对DNA甲基转移酶活性的检测具有重要意义。常用的检测DNA甲基转移酶活性的方法主要有高效液相色谱法、凝胶电泳法以及各种经PCR处理的方法等。但是，高效液相色谱法耗时且耗样量大，经PCR处理的方法对仪器的要求较高且操作过程繁琐，其他一些方法尚需复杂的样品处理过程等。近年来，检测DNA甲基转移酶活性的新方法得到迅速发展。如，利用金纳米棒的比色法检测DNA甲基转移酶活性；基于石墨烯和单双链DNA的结合能力不同的荧光法检测DNA甲基转移酶活性；利用荧光能量共振转移的荧光猝灭和恢复原理检测DNA甲基转移酶活性；基于DNA链取代放大法检测DNA甲基转移酶活性；基于阳离子聚合物和DNA形成复合物使荧光增强的方法检测DNA甲基转移酶活性等。虽然以上方法在检测DNA甲基转移酶活性中有着各自的优势，但是，这些方法仍然存在需要对DNA探针进行标记，阳离子聚合物的合成过程复杂，容易受其他非特异性的影响等问题。因此，发展高灵敏、特异性强、低成本的方法检测DNA甲基转移酶的活性仍然是个很大的挑战。电化学技术具有简单、容易操作、灵敏、响应速度快等特点，在DNA甲基转移酶分析和DNA甲基化监测、尤其在利用酶放大信号代替传统的DNA荧光标记来检测DNA甲基转移酶活性中有着潜在的应用价值。基于信号放大技术检测甲基转移酶活性以及筛选甲基转移酶抑制剂的方法，虽然比传统方法的灵敏度高，但是还远远不够。因此，本专利技术发展了一种基于酶剪切循环放大技术和双电信号相结合的方法高灵敏检测DNA甲基转移酶活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法，它具有检测灵敏高和选择性好的优点。本专利技术是这样实现的，基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，在含有5’-G-A-T-C-3’序列的发夹DNA溶液中加入Dam甲基转移酶，在37℃孵育4小时，Dam甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到发夹DNA的腺嘌呤的N6位置上；将溶液在65℃加热15分钟后冷却到室温，加入DpnI在37℃孵育3小时，DpnI将发生甲基化的发夹DNA从甲基化位点剪切为DNA碎片，释放出单链DNA；将预先制备好的二茂铁-DNA修饰金电极浸泡在以上溶液中，释放出的单链DNA与二茂铁-DNA的凸出部分杂交形成双链DNA，加入核酸外切酶III在37℃孵育3小时，核酸外切酶III从双链DNA的3’端进行剪切，释放出的单链DNA继续与电极表面的二茂铁-DNA的凸出部分杂交形成双链DNA而进入下一个剪切放大循环，如此循环，使得大量二茂铁脱离电极表面导致二茂铁的电流下降，同时电极表面的大量巯基化单链DNA被释放出来，将电极浸泡在含有血红素和钾离子的溶液中反应30分钟，形成的G-四链体-血红素复合物的电流增强，通过电化学工作站测量二茂铁和G-四链体-血红素复合物的电流，根据二者电流强度的比值与Dam甲基转移酶浓度的对数的线性关系实现Dam甲基转移酶的检测。作为优选，所述的发夹DNA溶液用浓度10mM、pH7.4且含100mMNaCl的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液配制。作为优选方案，上述的二茂铁-DNA修饰金电极按下述步骤制备：（1）电极预处理：金电极用新鲜配制的体积比为7:3的H2SO4:H2O2溶液浸泡20分钟，用超纯水冲洗电极，再分别用0.3µm和0.05µm的氧化铝粉在麂皮上抛光至金电极表面呈镜面，将电极分别在体积比为1:1的HNO3:H2O、乙醇和超纯水中分别超声1分钟，将清洗干净的电极在0.1M的H2SO4溶液中于-0.2V到+1.55V电位范围内进行循环伏安扫描，直到获得稳定的循环伏安峰；（2）制备二茂铁-DNA修饰金电极：巯基化DNA用100μL1mM的二硫苏糖醇溶液活化3小时后过柱；将步骤（1）处理好的金电极浸泡在50µL1µM活化后的巯基化DNA溶液中，室温下反应16小时，用超纯水清洗电极表面去除未反应的巯基化DNA；将电极浸入0.1M巯基己醇溶液中30分钟后，再浸泡在50µL1µM的二茂铁-DNA溶液中，在37°C反应2小时，用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液清洗电极表面，即制成二茂铁-DNA修饰金电极。作为优选，上述步骤中，步骤（2）中，所述的二硫苏糖醇溶液用浓度为170mM、pH8.0的磷酸盐缓冲溶液配制。作为优选，步骤（2）中，所述的巯基己醇溶液用无水乙醇配制。作为优选，步骤（2）中，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的浓度为10mM、pH7.4且含100mMNaCl。本专利技术的技术效果是：本专利技术发展了一种基于酶剪切循环放大技术和双电信号相结合的方法，用于高灵敏检测Dam甲基转移酶活性。由于本专利技术经过多次酶剪切和DNA循环放大以及与双电信号比例相结合，使得此方法对Dam甲基转移酶活性检测具有灵敏度高、检测限低、选择性好等特点。附图说明图1是二茂铁-DNA修饰电极在(a)DNA+Dam+DpnI+ExoIII，(b)DNA+DpnI+ExoIII，(c)DNA+Dam+ExoIII，(d)DNA+Dam+DpnI溶液中反应后的DPV曲线。图2是(A)裸电极，(B)巯基DNA修饰电极，(C)巯基DNA/二茂铁-DNA修饰电极，(D)电极(C)与DNA+Dam+DpnI+ExoIII溶液反应后的修饰电极的交流阻抗图。图3是实验条件优化：(A)SAM溶度，(B)DpnI溶度，(C)Dam反应时间，(D)ExoIII辅助循环放大反应时间。图4是（A）不同浓度Dam的DPV曲线。a–l分别为0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，2，5，10，20，40和80UmL-1的Dam。（B）校正曲线。图5是对Dam抑制剂的筛选。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步阐述，本专利技术并不限于此；实施例1（1）电极预处理：金电极用新鲜配制的体积比为7:3的H2SO4:H2O2溶液浸泡20分钟，用超纯水冲洗电极，再分别用0.3µm和0.05µm的氧化铝粉在麂皮上抛光至金电极表面呈镜面，将电极分别在体积比为1:1的HNO3:H2O、乙醇和超纯水中分别超声1分钟，将清洗干净的电极在0.1M的H2SO4溶液中于-0.2V到+1.55V的电位范围内进行循环伏安扫描，直到获得稳定的循环伏安峰；（2）制备二茂铁-DNA修饰金电极：巯基化DNA用100μL1mM的二硫苏糖醇溶液活化3小时后过柱；将步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，在含有5’‑G‑A‑T‑C‑3’序列的发夹DNA溶液中加入Dam甲基转移酶，孵育，Dam甲基转移酶将S‑腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到发夹DNA的腺嘌呤的N6位置上；将溶液在65 ℃加热15分钟后冷却到室温，加入Dpn I孵育，Dpn I将发生甲基化的发夹DNA从甲基化位点剪切为DNA碎片，释放出单链DNA；将预先制备好的二茂铁‑DNA修饰金电极浸泡在以上溶液中，释放出的单链DNA与二茂铁‑DNA的凸出部分杂交形成双链DNA，加入核酸外切酶III孵育，核酸外切酶III从双链DNA的3’端进行剪切，释放出的单链DNA继续与电极表面的二茂铁‑DNA的凸出部分杂交形成双链DNA而进入下一个剪切放大循环，如此循环，使得大量二茂铁脱离电极表面导致二茂铁的电流下降，同时电极表面的大量巯基化单链DNA被释放出来，将电极浸泡在含有血红素和钾离子的溶液中，形成的G‑四链体‑血红素复合物的电流增强，通过电化学工作站测量二茂铁和G‑四链体‑血红素复合物的电流，根据二者电流强度的比值与Dam甲基转移酶浓度的对数的线性关系实现Dam甲基转移酶的检测。...

【技术特征摘要】
1.基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，在含有5’-G-A-T-C-3’序列的发夹DNA溶液中加入Dam甲基转移酶，孵育，Dam甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到发夹DNA的腺嘌呤的N6位置上；将溶液在65°C加热15分钟后冷却到室温，加入DpnI孵育，DpnI将发生甲基化的发夹DNA从甲基化位点剪切为DNA碎片，释放出单链DNA；将预先制备好的二茂铁-DNA修饰金电极浸泡在以上溶液中，释放出的单链DNA与二茂铁-DNA的凸出部分杂交形成双链DNA，加入核酸外切酶III孵育，核酸外切酶III从双链DNA的3’端进行剪切，释放出的单链DNA继续与电极表面的二茂铁-DNA的凸出部分杂交形成双链DNA而进入下一个剪切放大循环，如此循环，使得大量二茂铁脱离电极表面导致二茂铁的电流下降，同时电极表面的大量巯基化单链DNA被释放出来，将电极浸泡在含有血红素和钾离子的溶液中，形成的G-四链体-血红素复合物的电流增强，通过电化学工作站测量二茂铁和G-四链体-血红素复合物的电流，根据二者电流强度的比值与Dam甲基转移酶浓度的对数的线性关系实现Dam甲基转移酶的检测；二茂铁-DNA修饰金电极按下述步骤制备：（1）电极预处理：金电极用新鲜配制的体积比为7:3的H2SO4:H2O2溶液浸泡20分钟，用超纯水冲洗电极，再分别用0.3µm和0.05µm的氧化铝粉在麂皮上抛光至金电极表面呈镜面，将电极分别在体积比为1:1的HNO3:H2O、乙醇和超纯水中分别超...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱建丁，李志坚，梁汝萍，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36