本发明专利技术涉及一种C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清及其制备方法；是将C型产气荚膜梭菌菌种和D型产气荚膜梭菌菌种分别接种于血平板培养基上复苏，再使用营养肉汤增菌厌氧培养，分别得到C型产气荚膜梭菌菌液和D型产气荚膜梭菌菌液，再利用产毒培养基培养灭活，对血清进行基础免疫和加强免疫后分离得到。本发明专利技术制备的C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清，效价高、特异性强、无毒副作用；可用于动物的C、D型产气荚膜梭菌病的免疫，可在研究预控控制C型、D型或C、D两型产气荚膜梭菌感染引起的羊猝狙，肠毒血症等病的流行中起到重大作用。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】c、D型产气芙膜梭菌抗毒素血清及其制备方法 (-)
本专利技术设及一种C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清及其制备方法。 (二）技术背景 产气英膜梭菌（C.per化ingens)又称魏氏梭菌（C.welchii)，是动物肠道的常在 菌，然而，当饲养、环境条件突然改变时它能够感染致病，为一种条件致病菌。该菌能够感染 多种动物，导致坏死性肠炎和肠毒血症等复杂的症状或病理变化。产气英膜梭菌根据其分 泌的四种主要外毒素（a、0、e、〇分为A、B、C、D、E五个亚型。C型产气英膜梭菌主要 致病毒素主要是a、P外毒素，它是多种家畜肠源毒血症和"巧死症"的主要病原，如仔猪 红频和羊巧狙。D型产气英膜梭菌主要产生a、e两种外毒素，能引起黑羊、绵羊、山羊、牛 W及灰鼠等动物的肠毒血症。近年来黑龙江、青海、云南、宁夏等地均有D型菌导致牛、羊等 动物肠毒血症的报道，给畜牧业造成了严重损失。农业部将该病列为畜禽的二类传染病。 在畜牧业养殖中，由于抗生素的使用，在选择压力下，病原不断的变异。产气英膜 梭菌的耐药谱越来越广，使得曾发挥巨大作用的抗生素在面对该些疾病时越来越无能为 力，常常让广大的养殖户遭受着极大的经济损失。抗血清又称高免血清或抗病血清，是一 种高效价、特异性抗体。 采用C、D两个亚型的混合血清，抗体丰富，覆盖面宽，在生产中可起到很好的预防 作用。在我国，C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清并没有制备和应用的报道。故此，本专利技术有 创新，并能够服务于畜牧生产。 (H)
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清及其制备 方法；利用本专利技术制备的C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清，效价高、特异性强、无毒副作用； 可用于动物的C、D型产气英膜梭菌病的免疫，可在研究预控控制C型、D型或C、D两型产气 英膜梭菌感染引起的羊巧狙，肠毒血症等病的流行中起到重大作用。 一种C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清，其制备方法包括W下步骤： 1.将3ulC型产气英膜梭菌菌种和D型产气英膜梭菌菌种分别接种于血平板培养 基上复苏，再使用营养肉汤培养基增菌厌氧培养，分别得到C型产气英膜梭菌菌液和D型产 气英膜梭菌菌液。[000引 2.将4mlC型产气英膜梭菌菌液和3mlD型产气英膜梭菌菌液加入到100ml pH7.5的产毒培养基中，在厌氧环境下振荡培养，44°C培养化高效产毒，然后4°C 4000g离 屯、15min，再用孔径0. 22ym的蔡氏滤器中过滤除菌，得到C、D型产气英膜梭菌外毒素溶 液，作为C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清的第二免疫原。 3.在C、D型产气英膜梭菌外毒素溶液中加入其体积比0. 3%的甲醒溶液，充分振 荡混匀，37°C灭活12她，期间每隔5-化振摇一次，得到灭活好的C、D型产气英膜梭菌类毒 素溶液。按照C、D型产气英膜梭菌类毒素溶液和白油佐剂体积比1:2向灭活好的C、D型产 气英膜梭菌类毒素溶液中加入灭菌的白油佐剂乳化，得到C、D型产气英膜梭菌二价白油类 毒素疫苗，作为C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清的第一免疫原。 4.C、D型产气英膜梭菌抗毒素血清制备分为基础免疫和加强免疫；先用第一免疫 原对成年健壮的健康绵羊进行两次基础免疫；肌肉分点注射C、D型产气英膜梭菌二价类毒 素白油疫苗；再使用第二免疫原进行四次加强免疫；肌肉分点注射除菌C、D型产气英膜梭 菌外毒素溶液。按W下免疫程序进行： 免疫程序【主权项】1. 一种C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清，其特征在于通过以下方法制备得到： 1) 将3ul C型产气荚膜梭菌菌种和D型产气荚膜梭菌菌种分别接种于血平板培养基上 复苏后使用营养肉汤培养基增菌厌氧培养，分别得到C型产气荚膜梭菌菌液和D型产气荚 膜梭菌菌液； 2) 将4ml C型产气荚膜梭菌菌液和3ml D型产气荚膜梭菌菌液加入到100mL pH7. 5的 产毒培养基中，在厌氧环境下振荡培养，44°C培养5h高效产毒，然后4°C 4000g离心15min， 再用孔径0. 22 μ m的蔡氏滤器中过滤除菌，得到C、D型产气荚膜梭菌外毒素溶液，作为C、 D型产气荚膜梭菌抗毒素血清的第二免疫原； 3) 在C、D型产气荚膜梭菌外毒素溶液中加入其体积比0. 3%的甲醛溶液，充分振荡混 匀，37°C灭活128h，期间每隔5-6h振摇一次，得到灭活好的C、D型产气荚膜梭菌类毒素溶 液；按照⑶型产气荚膜梭菌类毒素溶液和白油佐剂体积比1:2向灭活好的C、D型产气荚膜 梭菌类毒素溶液中加入灭菌的白油佐剂乳化，得到C、D型产气荚膜梭菌二价白油类毒素疫 苗，作为C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清的第一免疫原； 4. C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清制备分为基础免疫和加强免疫；先用第一免疫原对 成年健壮的健康绵羊进行两次基础免疫：肌肉分点注射C、D型产气荚膜梭菌二价类毒素白 油疫苗；再使用第二免疫原进行四次加强免疫：肌肉分点注射除菌C、D型产气荚膜梭菌外 毒素溶液；具体免疫程序如下表： 免疫程序5) 最后一次免疫IOd后静脉无菌采血，分离血清，得到C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血 清； 所述的血平板培养基成分为：100毫升蒸馏水、3. 7g豆粉琼脂、Ig葡萄糖和5ml绵羊 血； 所述的营养肉汤培养基成分：1〇〇毫升蒸馏水、蛋白胨lg、牛肉粉〇.3g、生理盐水 〇. 5g ； 所述的产毒培养基成分为：每100mLPBS缓冲液溶解3g胰蛋白胨、2g糊精、2g酵母浸膏 和2. 2gL-精氨酸；PBS缓冲液成分为：IL去离子水、0. 27g磷酸二氢钾（KH2P04)、I. 42g磷 酸氢二钠（Na2HP04)、8g氯化钠（NaCl)和(λ 2g氯化钾（KCl)。【专利摘要】本专利技术涉及一种C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清及其制备方法；是将C型产气荚膜梭菌菌种和D型产气荚膜梭菌菌种分别接种于血平板培养基上复苏，再使用营养肉汤增菌厌氧培养，分别得到C型产气荚膜梭菌菌液和D型产气荚膜梭菌菌液，再利用产毒培养基培养灭活，对血清进行基础免疫和加强免疫后分离得到。本专利技术制备的C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清，效价高、特异性强、无毒副作用；可用于动物的C、D型产气荚膜梭菌病的免疫，可在研究预控控制C型、D型或C、D两型产气荚膜梭菌感染引起的羊猝狙，肠毒血症等病的流行中起到重大作用。【IPC分类】C07K16-06, C07K16-12【公开号】CN104829712【申请号】CN201510202093【专利技术人】柴同杰, 刘雪慧, 王海荣 【申请人】山东农业大学【公开日】2015年8月12日【申请日】2015年4月23日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清，其特征在于通过以下方法制备得到：1)将3ul C型产气荚膜梭菌菌种和D型产气荚膜梭菌菌种分别接种于血平板培养基上复苏后使用营养肉汤培养基增菌厌氧培养，分别得到C型产气荚膜梭菌菌液和D型产气荚膜梭菌菌液；2)将4ml C型产气荚膜梭菌菌液和3ml D型产气荚膜梭菌菌液加入到100ml pH7.5的产毒培养基中，在厌氧环境下振荡培养，44℃培养5h高效产毒，然后4℃4000g离心15min，再用孔径0.22μm的蔡氏滤器中过滤除菌,得到C、D型产气荚膜梭菌外毒素溶液，作为C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清的第二免疫原；3)在C、D型产气荚膜梭菌外毒素溶液中加入其体积比0.3％的甲醛溶液，充分振荡混匀，37℃灭活128h，期间每隔5‑6h振摇一次，得到灭活好的C、D型产气荚膜梭菌类毒素溶液；按照CD型产气荚膜梭菌类毒素溶液和白油佐剂体积比1:2向灭活好的C、D型产气荚膜梭菌类毒素溶液中加入灭菌的白油佐剂乳化，得到C、D型产气荚膜梭菌二价白油类毒素疫苗，作为C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清的第一免疫原；4)C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清制备分为基础免疫和加强免疫；先用第一免疫原对成年健壮的健康绵羊进行两次基础免疫：肌肉分点注射C、D型产气荚膜梭菌二价类毒素白油疫苗；再使用第二免疫原进行四次加强免疫：肌肉分点注射除菌C、D型产气荚膜梭菌外毒素溶液；具体免疫程序如下表：免疫程序5)最后一次免疫10d后静脉无菌采血，分离血清，得到C、D型产气荚膜梭菌抗毒素血清；所述的血平板培养基成分为：100毫升蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5ml绵羊血；所述的营养肉汤培养基成分：100毫升蒸馏水、蛋白胨1g、牛肉粉0.3g、生理盐水0.5g；所述的产毒培养基成分为：每100mlPBS缓冲液溶解3g胰蛋白胨、2g糊精、2g酵母浸膏和2.2gL‑精氨酸；PBS缓冲液成分为：1L去离子水、0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)、1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)、8g氯化钠(NaCl)和0.2g氯化钾(KCl)。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柴同杰，刘雪慧，王海荣，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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